По данным эпидемиологических исследований, бронхиальной астмой (БА) страдает 5-10% детского населения. БА — хроническое воспалительное заболевание респираторного тракта, в котором участвуют многие клетки врожденной и адаптивной иммунной системы совместно с эпителиальными клетками, вызывая основные клинические синдромы, характерные для данного заболевания.
Существует мнение, что БА гетерогенна. Выделяют различные ее фенотипы и эндотипы, которые определяются особенностями взаимодействия генетических и средовых факторов, различаются возрастом начала заболевания, клиническими проявлениями, спектром биомаркеров, прогнозом и ответом на традиционные и новые терапевтические воздействия.
При этом продемонстрировано, что фенотипы астмы, диагностированные с учетом превалирования тех или иных воспалительных клеточных популяций в мокроте, в течение 12-месячного периода наблюдения не были стабильными.
Иммунологические механизмы, лежащие в основе БА, преимущественно опосредованы Т-лимфоцитами-хелперами 2-го типа (Th2), ассоциированы с гиперпродукцией иммуноглобулинов Е и формированием эозинофильного варианта воспаления в респираторном тракте.
Однако некоторые аспекты эозинофильного воспаления могут быть ассоциированы с активацией лимфоидных клеток 2-го типа врожденного иммунитета (innate lymphoid cells 2 — ILC-2), действующих совместно с базофилами. Кроме того, для некоторых фенотипов БА характерно преимущественно нейтрофильное воспаление, контролируемое подмножеством Th17 хелперных Т-клеток.
У большинства детей формирование БА связано с Тh2-вариантом иммунного ответа, атопией, врожденной склонностью к гиперпродукции общего и специфического IgE, снижением функциональной активности T-reg-клеток (Th3, Tr1, CD4-, CD25+) и дисбалансом Th1/ Th2.
Взаимодействие на поверхности тучных клеток и базофилов специфических IgE с причиннозначимыми аллергенами индуцирует высвобождение преформированных и синтезируемых de novo медиаторов, вызывающих развитие острого воспаления бронхов, сопровождающегося миграцией клеток в слизистую оболочку дыхательных путей и формированием клеточного инфильтрата, включающего эозинофилы, базофилы, Тh2-лимфоциты с участием макрофагов, моноцитов, дендритных, тучных и эпителиальных клеток, тромбоцитов, нейтрофилов, фибробластов.
Выделяемые тучными клетками, эозинофилами, базофилами, ТИ2-лимфоцитами провоспалительные цитокины способствуют формированию хронического воспаления. Миграция провоспалительных клеток из сосудистого русла в межклеточное пространство происходит под влиянием хемокинов и адгезивных молекул.
Персистированию аллергического воспаления в дыхательных путях при БА способствуют длительная экспозиция причинно-значимых аллергенов, наличие у больного высокого индекса атопии, высвобождение нервными клетками воспалительных нейрокинов (субстанции Р, нейрокинов А и В), наслоение вирусной, бактериальной или атипичной (хламидийной, микоплазменной) инфекций.
Так как астма характеризуется рецидивирующей вариабельной обструкцией дыхательных путей, уровень контроля данного заболевания можно оценить, опираясь на выраженность его симптомов, значения параметров внешнего дыхания, результаты функциональных тестов, отражающих вариабельность проходимости бронхов и бронхиальную гиперреактивность.
В связи с тем, что центральное место в патогенезе астмы занимает воспаление дыхательных путей, его мониторинг должен стать составной частью планов ведения пациентов. В настоящее время наиболее изученным биомаркером воспаления при БА является уровень оксида азота и его метаболитов в выдыхаемом воздухе.
Активно в этой связи изучаются также клеточный состав индуцированной мокроты, компоненты конденсата выдыхаемого воздуха (pH, лейкотриены, альдегиды и другие параметры). Новым аналитическим методом детекции биомаркеров в конденсате выдыхаемого воздуха является метаболомика.
Биомаркеры могут быть использованы также для диагностики основных фенотипов и эндотипов астмы. Так, например, уровни Feno, сывороточного периостина, эозинофильного нейротоксина и остеопонтина могут быть использованы для диагностики и мониторирования ТИ2-зависимого эозинофильного варианта воспаления при БА.
Персистирование аллергического воспаления в дыхательных путях лежит в основе неконтролируемого течения БА. Достижение у больного полного контроля над течением астмы является главной целью проводимого лечения при данном заболевании. В связи с тем, что воспаление дыхательных путей — это основное патогенетическое звено, определяющее течение БА, возникает необходимость проведения противовоспалительной терапии в качестве базисного лечения.
Для достижения и поддержания контроля над симптомами и течением БА в настоящее время используются следующие группы фармакологических средств:
- ингаляционные глюкокортикостероиды (ГКС),
- антагонисты лейкотриеновых рецепторов,
- кромоны,
- бета-2-агонисты,
- теофиллины длительного действия.
При тяжелой и резистентной к указанным фармакологическим препаратам астме применяются системные ГКС и анти-IgE-терапия. Кроме того, для патогенетической терапии БА в настоящее время разрабатываются и иные лекарственные препараты — антицитокинового и антимедиаторного действия.
Глюкокортикостероиды обладают высоким противовоспалительным и противоаллергическим действием, связанным с их способностью активировать противовоспалительные гены и подавлять многие из провоспалительных генов, которые были инициированы в процессе воспаления.
В результате наблюдаются ингибирование синтеза провоспалительных цитокинов, липидных медиаторов (лейкотриенов, простагландинов), торможение участия эозинофилов в развитии аллергического воспаления и экскреции эозинофильных медиаторов.
При БА назначаются прежде всего ингаляционные ГКС, что позволяет нивелировать возникновение системных побочных эффектов, свойственных этим препаратам. В результате лечения ими на 5-7-й день от начала терапии у большинства пациентов с недостаточным уровнем контроля БА отмечается исчезновение бронхообструктивного синдрома. К 3-й неделе лечения наблюдаются нормализация или значительное улучшение функции внешнего дыхания, снижение неспецифической бронхиальной гиперреактивности.
Терапия стартовой дозой ингаляционных ГКС проводится, как правило, в течение 3 мес и затем, при отсутствии симптомов, их суточная доза постепенно снижается до поддерживающей, предупреждающей обострение астмы. Поддерживающую дозу больные могут получать в течение нескольких лет. Применение ингаляционных ГКС повышает качество жизни больных БА.
Для проведения базисной противовоспалительной терапии при БА у детей в настоящее время используются следующие ингаляционные ГКС: беклометазона дипропионат, будесонид, циклесонид, флутиказона пропионат, мометазона фуроат. Эти препараты обладают высоким сродством к глюкокортикостероидным рецепторам, способны достигать высоких и длительно сохраняющихся терапевтических концентраций в тканях при местном использовании, быстро инактивируются за счет биотрансформации в печени после системной абсорбции. Наличие высокой местной противовоспалительной активности и низкой системной биодоступности является важным фактором эффективности и безопасности ингаляционных ГКС.
Беклометазона дипропионат — ингаляционный ГКС, обладающий значительной противовоспалительной активностью при наличии небольшого системного действия. Более 40 лет используется в терапии БА и продемонстрировал клиническую эффективность и благоприятный профиль безопасности у детей и взрослых с хронической персистирующей астмой.
Беклометазона дипропионат представляет собой пролекарство, которое в легких гидролизуется до беклометазона монопропионата, а он в свою очередь гидролизуется до беклометазона. Суточная доза беклометазона дипропионата составляет 200-1200 мкг и вводится в 3-4 приема.
Беклометазона дипропионат является действующей субстанцией в аэрозоли «Кленил с Джет-системой». Джет-система повышает депозицию аэрозоля в легких и снижает отложение его частиц в ротоглотке, что позволяет уменьшить риск развития орофарингеального кандидоза, кашля, осиплости голоса и системное воздействие препарата.
Одна ингаляционная доза содержит 200 или 250 мкг беклометазона дипропионата. Детям 6-12 лет назначается по 250 мкг 2 раза в сутки, у детей старше 12 лет при легкой БА суточная доза составляет 200-600 мкг за 2 ингаляции, при астме средней тяжести — 600- 1000 мкг за 2-4 ингаляции, при тяжелой астме — 1000-2000 мкг за 2-4 ингаляции.
Кленил УДВ представляет собой препарат на основе беклометазона дипропионата для небулайзерной терапии БА, выпускается в виде суспензии в ампулах, содержащих 800 мкг беклометазона дипропионата. Детям старше 6 лет препарат назначается по половине одноразовой ампулы для небулизации в дозе 400 мкг 1-2 раза в день.
Будесонид, уже 35 лет использующийся для терапии астмы, является единственным негалогенизированным ингаляционным ГКС. Препарат на 90% метаболизируется в печени и выводится из организма в виде неактивных продуктов обмена. В клетках при взаимодействии будесонида с жирными кислотами образуются комплексы, которые представляют собой внутриклеточные депо препарата.
Пульмикорт Турбухалер — это порошок будесонида, доставляемый в бронхи с помощью турбухалера. Одна ингаляционная доза Пульмикорта Турбухалера содержит 200 мкг препарата. Пульмикорт Турбухалер назначают детям старше 7 лет в суточной дозе 400-800 мкг в 2-4 приема.
Для лечения обострений БА у детей широкое применение находит суспензия Пульмикорта на основе будесонида, выпускаемая в небулах (для небулайзерной терапии). Используется также аналог Пульмикорта — Буденит Стери-Неб, дозированная суспензия. Для лечения детей с БА доза Пульмикорта в суспензии подбирается индивидуально, для детей в возрасте 6 мес и старше начальная доза этого препарата составляет 0,25-0,5 мг/сут. При необходимости доза может быть увеличена до 1 мг/сутки.
Бенакорт — отечественный глюкокортикостероидный препарат на основе будесонида. Препарат представляет собой порошок в ингаляторе циклохалер, содержащем 400 доз будесонида. В качестве наполнителя используется бензоат натрия, обладающий противогрибковой активностью. Другой формой Бенакорта является порошок для ингаляций в виде капсул (200 доз). Применяется у детей старше 7 лет в суточной дозе 400-800 мкг в 2-3 приема.
Флутиказона пропионат обладает выраженной противовоспалительной активностью. Терапия этим ингаляционным ГКС в течение 6 мес и более дает возможность добиться контроля над БА и достичь клинической ремиссии болезни.
Фликсотид — дозированный аэрозоль для ингаляций, выпускается во флаконах, 60 (120) ингаляционных доз по 125/250 мкг препарата, а также в виде порошка в ротодисках, в которых одна ингаляционная доза препарата может содержать 50, 100, 250 и 500 мкг флутиказона пропионата. В зависимости от тяжести течения БА Фликсотид назначается детям старше 4 лет в суточной дозе 100-500 мкг в 2 приема.
Циклесонид является экстрамелкодисперсным ингаляционным ГКС. Депозиция циклесонида происходит как в центральных, так и в периферических отделах бронхов. По своему механизму действия препарат является пролекарством, которое активируется в эндотелиальных клетках дыхательных путей с образованием активного метаболита дезциклесонида, имеющего в 100 раз большее сродство к глюкокортикостероидным рецепторам по сравнению с циклесонидом. Лечение циклесонидом способствует улучшению контроля БА, препарат обладает высокой клинической эффективностью.
Альвеско выпускается в виде аэрозольных упаковок с содержанием 40, 80 и 160 мкг в 1 ингаляционной дозе. Применяется при БА у детей с шестилетнего возраста. Доза препарата в зависимости от тяжести БА составляет 80-300 мкг.
Мометазона фуроат — ГКС, обладающий самой высокой аффинностью к глюкокортикостероидным рецепторам по сравнению с другими ГКС для ингаляционного применения при БА, что наряду с продолжительным периодом полужизни коррелирует с высоким уровнем терапевтической эффективности и безопасности.
Преимуществом Асманекса Твистхейлер является возможность применения препарата 1 раз в день, что способствует повышению приверженности больных лечению. Форма выпуска препарата в разных дозах (200 и 400 мкг) соответствует требованиям, предъявляемым к ступенчатой терапии БА, и позволяет повышать или снижать дозу в соответствии с характеристиками достигаемого контроля астмы.
Терапия низкими и средними дозами ингаляционных ГКС сводит к минимуму возможность возникновения системных побочных эффектов. Однако при терапии ингаляционными ГКС следует учитывать рост ребенка и рекомендовать использовать минимальные эффективные дозы препаратов у всех детей с БА.
Ингаляционные ГКС являются наиболее эффективными противовоспалительными препаратами, обеспечивающими достижение и поддержание контроля над симптомами и течением большинства случаев БА. Однако встречаются случаи стероидорезистентности, что требует увеличения доз препаратов и сопряжено с повышением риска формирования нежелательных побочных эффектов.
Понимание молекулярных механизмов действия ГКС позволяет детализировать причины формирования глюкокортикостероидной резистентности. В настоящее время установлено, что врожденная стероидорезистентность, связанная с мутациями в генах, кодирующих глюкокортикостероидные рецепторы, встречается при БА очень редко.
Чаще наблюдается приобретенная стероидорезистентность, которая при астме обусловлена главным образом модификацией глюкокортикостероидных рецепторов: под влиянием Тh2-провоспалительных цитокинов, продуктов нитрозилирующего и оксидативного стресса, микробных и грибковых суперантигенов, а также деградацией их под влиянием протеаз.
Проблему стероидорезистентности в настоящее время пытаются решить двояко. С одной стороны, продолжается интенсивное изучение фенотипов и эндотипов БА с целью определения когорт пациентов, у которых патогенетические особенности заболевания обусловливают исходную резистентность к ГКС (например, Тh17-опосредованные, преимущественно нейтрофильные варианты воспаления при БА). С другой стороны, интенсивно разрабатываются подходы к увеличению противовоспалительной активности ГКС, снижению вероятности нежелательных побочных эффектов данных препаратов. Эта работа осуществляется по трем направлениям.
- Комбинированная терапия — добавление к ингаляционным ГКС второго препарата для того, чтобы преодолеть стероидорезистентность и уменьшить дозы ГКС, необходимые для достижения клинического эффекта. Такими свойствами обладают пролонгированные бета-2-агонисты.
В настоящее время в клинической разработке имеются и новые препараты, такие как селективные ингибиторы р38-МАРК (митогенактивированной протеинкиназы). Ингибитор р38-МАРК оказывает влияние на транскрипцию генов, кодирующих синтез многих провоспалительных цитокинов, включая ФНО-а, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-8, RANTES и эотаксин, и тем самым на патогенез астмы.
Некоторые проявления стероидорезистентности могут быть нивелированы малыми дозами теофиллина. В качестве перспективных направлений рассматривается и применение антиоксидантов.
- Создание пропрепаратов (по типу цикпесонида, превращаемого в легких в его активную форму — С21 — деметилпропионил-циклесонид, что сопровождается низкой орально-глоточной абсорбцией), а также препаратов с высоким сродством к глюкокортикостероидным рецепторам, что позволяет вводить препараты 1 раз в день (циклесонид, флутиказона фуроат, мометазона фуроат).
- Разработка диссоциированных ГКС, которые оказывали бы различные по силе эффекты на процессы трансрепрессии и трансактивации генов, что позволило бы модулировать и нежелательные побочные эффекты данных препаратов.
Одним из способов повышения эффективности ингаляционных ГКС и преодоления стероидорезистентности при БА является использование комбинированной терапии. Наибольшее практическое применение в этой связи получили фиксированные комбинации ГКС и бета-2-агонистов длительного действия: флутиказона пропионат и сальметерола ксинафоат (Серетид, Тевакомб), будесонид и формотерола фумарат (Симбикорт), беклометазона дипропионат и формотерола фумарат (Фостер).
Комбинированная терапия сочетаниями препаратов такого рода является более эффективным методом лечения детей с тяжелым и среднетяжелым течением БА по сравнению с изолированным использованием ингаляционных ГКС.
Флутиказона пропионат + сальметерола ксинафоат (оригинальная комбинация — Серетид, GlaxoSmithKline, Великобритания) выпускается в форме порошкового ингалятора — Серетид Мультидиск, каждая доза которого содержит 50 мкг сальметерола ксинафоата и 100, 250 и 500 мкг флутиказона пропионата, и в форме дозированного аэрозольного ингалятора (без фреона), каждая доза которого содержит 25 мкг сальметерола ксинафоата и 50, 125 и 250 мкг флутиказона пропионата.
Применяется в режиме стабильного дозирования с четырех лет жизни. Доза Серетида определяется возрастом ребенка и тяжестью БА. Эффективность лечения проявляется уменьшением симптомов и обострений БА, достижением у ряда больных клинической ремиссии. Отмечается хорошая переносимость препарата.
Будесонид + формотерола фумарат (оригинальная комбинация — Симбикорт Турбухалер, Astra Zeneca, Швеция) — препарат для ингаляционного применения у детей с 6 лет жизни. Больным 6-12 лет препарат рекомендован в режиме 80/4,5 мкг/дозу по 2 ингаляции 2 раза в сутки, детям 12 лет и старше — 160/4,5 мкг/дозу по 1-2 ингаляции 2 раза в сутки.
При терапии Симбикортом Турбухалером возможен гибкий режим дозирования с увеличением дозы в период обострения (до 2 ингаляций 2 раза в сутки) и снижением до поддерживающей дозы (по 1 ингаляции 1 раз в сутки) при стабильном состоянии больных. Наблюдается хорошая переносимость препарата.
Беклометазона дипропионат + формотерола фумарат (оригинальная комбинация — Фостер, Chiesi, Италия) представляет собой фиксированную комбинацию 100 мкг экстрамелкодисперсного беклометазона дипропионата и 6 мкг формотерола фумарата в разовой дозе в дозированном аэрозольном ингаляторе технологии «Модулит». Препарат применяется у детей старше 12 лет по 1-2 ингаляции 2 раза вдень. Лечение способствует уменьшению частоты симптомов БА и количества ее обострений, отмечена хорошая переносимость препарата.
Флутиказона фуроат + вилантерола трифенатат— это комбинация ингаляционного ГКС и бета-агониста ультрадлительного действия (оригинальная комбинация — Breo Ellipta, GlaxoSmithKline, Великобритания) с введением один раз в день. Проведены клинические исследования III фазы у подростков в возрасте от 12 лет и старше и у взрослых пациентов с астмой. Эффективность однократного применения 100/25 мкг препарата вдень сопоставима с результатами применения 250/50 мкг флутиказона пропионата + сальметерол дважды в день у больных с персистирующей астмой, не контролируемой ингаляционными ГКС в средних дозах после 24 нед лечения.
Мометазона фуроат + формотерола фумарат — оригинальная комбинация Зенхейл, ЗМ Health Саге Ltd. (США); Organon (Ирландия). В дозировках 100/5 и 200/5 мкг 2 раза в день рекомендован для лечения БА у подростков и взрослых.
Флутиказона пропионат + формотерола фумарат— оригинальная комбинация Flutiform, SkyePharma (Швейцария). Продемонстрировано, что в дозе 250/10 мкг обеспечивает более высокую эффективность по сравнению с монотерапией флутиказоном пропионатом для контролирования среднетяжелой и тяжелой БА, с профилем безопасности, аналогичным монотерапии флутиказоном пропионатом.
Назначение ингаляционных ГКС и комбинированных препаратов целесообразно прежде всего при персистирующей среднетяжелой или тяжелой БА. Их применение при легкой персистирующей форме астмы эффективно, но не всегда является столь необходимым, поскольку достичь контроля течения можно и нестероидной противовоспалительной терапией (кромоны, антагонисты лейкотриеновых рецепторов).
Предполагают, что в некоторых случаях альтернативой бета-2-агонистам длительного действия при БА могут быть антихолинергические средства длительного действия, в том числе в сочетании с ингаляционными ГКС. Данная идея в настоящее время вызывает большой интерес. В этой связи активно изучаются антихолинергические средства длительного действия.
- Тиотропия бромид, в том числе в сочетании с ингаляционными ГКС, находится в III фазе клинических исследований возможностей применения для лечения детской и подростковой астмы. У взрослых пациентов с астмой введение в терапию данного препарата было связано со значительным снижением частоты развития обострений.
- Умеклидиниума бромид находится в настоящее время на этапе II фазы клинических исследований возможности использования для лечения астмы в качестве как монотерапии, так и варианта, комбинированного с ингаляционными ГКС лечения.
- Аклидиниума бромид — проводимые исследования свидетельствуют о бронходилатирующем и противовоспалительном эффекте.
Антагонисты лейкотриеновых рецепторов имеют широкое применение в лечении БА у детей.
Монтелукаст натрия (Сингуляр, Монтелар, Монте- ласт, Синглон) ингибирует цистеиниловые лейкотриеновые рецепторы, применяется у детей с 2 лет. Доза его в 2-5 лет составляет 4 мг в жевательной таблетке, в 6-14 лет — 5 мг в жевательной таблетке 1 раз в сутки, для детей 15 лет и старше — 1 таблетка, покрытая оболочкой, 10 мг в сутки.
Этот препарат предупреждает возникновение дневных и ночных симптомов БА, снижает частоту ее обострений приаспириновой, вирус-индуцированной астме и астме физического усилия, уменьшает проявления сопутствующего аллергического ринита, персистирующего и интермиттирующего.
Монтелукаст натрия используется в качестве монотерапии для контроля легкой астмы; в комбинации с ингаляционными ГКС может быть эффективным при среднетяжелой и тяжелой астме, позволяя снизить дозу ГКС. Препарат также применяется на этапе отмены или снижения дозы ГКС для сохранения достигнутого контроля БА. Переносимость монтелукаста натрия хорошая, сравнительно редко отмечаются головная боль, тошнота.
Теофиллин используется для лечения заболеваний дыхательных путей уже более 100 лет. Первоначально он применялся как бронхолитическое средство, но относительно высокие дозы, необходимые для купирования бронхиальной обструкции данным препаратом, вызывают нежелательные побочные эффекты, поэтому его использование с данной целью сократилось.
Однако при более низких концентрациях для теофиллина свойственны противовоспалительные эффекты, обусловленные ингибированием PDE4 и активацией гистондезацетилазы-2, в результате чего происходит выключение активированных воспалительных генов. Благодаря этому механизму теофиллин уменьшает стероидорезистентность, что может иметь особое значение у пациентов с тяжелой астмой.
Препараты метилксантинового ряда ингибируют А1-рецепторы к аденозину, вызывая бронходилатирующий эффект, тормозят высвобождение тучными клетками и базофилами медиаторов воспаления, усиливают апоптоз эозинофилов, ингибируя развитие воспаления в дыхательных путях.
В настоящее время в терапии БА используются преимущественно небольшие дозы медленно высвобождаемых теофиллинов (Неотеопек А, Теопэк, Вентакс, Теотард, Этифиллин и др.). У детей с БА пролонгированные теофиллины могут быть назначены с противовоспалительной целью в невысоких дозах как компонент базисной терапии в течение 1-2 мес.
Терапия дюрантными теофиллинами способствует урежению приступов астмы, повышению толерантности к физической нагрузке, снижению у некоторых больных дозы ингаляционных ГКС. Переносимость теофиллинов в данных дозах у большинства детей хорошая. В единичных случаях отмечаются нарушение сна, тахикардия, тошнота, рвота, головные боли из-за ингибирования фосфодиэстеразы, при более высоких концентрациях наблюдаются сердечные аритмии.
У детей с тяжелым течением БА при недостаточной эффективности лечения ингаляционными ГКС и длительного действия бета-2-агонистами дополнительное назначение монтелукаста натрия и дюрантных теофиллинов позволяет повысить эффективность терапии и достичь контроля заболевания.
Рофлумиласт — ингибитор фосфодиэстеразы 4 — одобрен для применения у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких. Его потенциальные противовоспалительные эффекты были продемонстрированы в небольшом рандомизированном плацебоконтролируемом клиническом исследовании у пациентов с мягкой аллергической астмой.
Кромоны (кромоглициевая кислота и недокромил натрия) способны при экспозиции с причинно-значимым аллергеном предотвращать развитие бронхоспазма, ранней и поздней фазы аллергической реакции, тормозить повышение реактивности бронхов, эффективны преимущественно у детей с легким течением БА. Данная группа препаратов мало влияет на уже развившееся обострение заболевания.
Кромогликат натрия выпускается как в виде дозированных аэрозолей, так и в виде 2% раствора по 2 мл для ингаляций через небулайзер. Кратность ингаляций препаратов кромоглициевой кислоты составляет 4 раза в день. Для базисной терапии целесообразно длительное, не менее 3 мес применение препарата.
При легкой астме кромогликат натрия используют для профилактики сезонных обострений заболевания и для предупреждения обострений БА при физическом напряжении. Препарат хорошо переносится. Побочные явления редки, проявляются в основном местной реакцией в виде раздражения верхних дыхательных путей, кашля, редко — бронхоспазма.
Недокромил натрия (Тайлед) подавляет высвобождение медиаторов воспаления из тучных клеток, эозинофилов, нейтрофилов, моноцитов, макрофагов и тромбоцитов, тормозит развитие бронхоспазма, поздние аллергические реакции, снижает неспецифическую гиперреактивность бронхов и частоту обострений БА. Препарат выпускается в виде дозированного аэрозоля, применяется у детей старше 2 лет по 2 мг (1 ингаляционная доза) 2-4 раза в сутки.
При тяжелом, рефрактерном к традиционной фармакотерапии течении БА эффективной может быть анти-IgE-терапия, основанная на парентеральном введении анти-IgE-антител в виде препарата омализумаб (Ксолар).
Омализумаб связывает свободноциркулирующие в крови IgE, снижает продукцию высокоаффинных рецепторов на мембране тучных клеток и базофилов, что приводит к уменьшению экскреции медиаторов, выраженности аллергического воспаления и обратному развитию обострения БА.
Перед началом лечения рассчитывается индивидуальная доза омализумаба с учетом уровня общего IgE в периферической крови и массы тела ребенка, препарат вводится подкожно. Омализумаб способствует снижению частоты обострений БА, количества госпитализаций и обращений за неотложной помощью, уменьшению объема базисной терапии с достижением в большинстве случаев полного контроля болезни.
После начала терапии в отдельных случаях может отмечаться головная боль, а в месте его подкожного введения — возникновение отека, эритемы, зуда. Основным показанием к назначению омализумаба является тяжелая БА у детей 6 лет и старше, рефрактерная к проводимой фармакотерапии.
Основываясь на традиционных сведениях о Тh2-зависимом генезе астмы и эозинофильном воспалении дыхательных путей при данном заболевании, мишенями антицитокиновой терапии помимо IgE следует рассматривать также интерлейкины ИЛ-5, ИЛ-13, ИЛ-4, ИЛ-9.
Анти-интерлейкин-5-антитела. ИЛ-5 задействован в активации и созревании эозинофилов. Меполизумаб анти-ИЛ-5-антитела — в ходе III фазы клинического исследования DREAM, включавшем пациентов в возрасте 12-74 лет с рецидивирующим тяжелым течением БА и признаками эозинофильного воспаления, продемонстрировал эффективность терапии, в том числе в виде снижения обострений БА на 52% в год.
В настоящее время в рамках III этапа клинических исследований проводится изучение антител к рецептору ИЛ-5 (Benralizumab), эффекты истощения эозинофилов наблюдаются в течение нескольких месяцев после одной инъекции данного препарата.
Анти-интерлейкин-13-антитела. ИЛ-13 является важным медиатором БА и воспроизводит большинство ее характеристик в экспериментальных моделях, в том числе ремоделирование, гиперпродукцию слизи, синтез IgE, рекрутирование эозинофилов и базофилов.
Для оценки эффективности анти-ИЛ-13-терапии используется новый сывороточный биомаркер астмы периостин, который является компонентом внеклеточного матрикса, полученного из эпителиальных клеток дыхательных путей в ответ на воздействие ИЛ- 13 и ИЛ-4, высвобождение его подавляется ГКС. Содержание сывороточного периостина позволяет дифференцировать пациентов с «выраженным» и с «невыраженным» Тh2-фенотипом БА.
Специфические анти-ИЛ-13-антитела — препараты Lebrikizumab, Tralokinumab, Anrukinzumab Lebrikizumab вводят подкожно один раз в месяц. В рандомизированном многоцентровом исследовании (219 пациентов) препарат был эффективнее у пациентов с исходным более высоким уровнем периостина в сыворотке крови.
Анти-интерлейкин-4-антитела. ИЛ-4 участвует в дифференцировке ТЬ2-клеток, переключении на синтез IgE, рекрутировании эозинофилов и тучных клеток.
Altrakincept — растворимые рекомбинантные человеческие рецепторы к ИЛ-4, предназначенные для ингаляционной терапии. Данный препарат нейтрализует активацию иммунных и иных клеток, вызываемую ИЛ-4. Однократная ингаляция этого препарата у взрослых с умеренной астмой приводит к улучшению функции легких и снижению уровня выдыхаемого оксида азота.
Pitrakinra — антагонист гетеродимерного рецепторного комплекса — ИЛ-4R-ИЛ-13Ра — разработан для преодоления биологической избыточности ИЛ-4 и ИЛ-13, что, возможно, компенсирует неэффективность стратегий, направленных только на учет ИЛ-4. Pitrakinra ингибирует аллергениндуцированные аллергические реакции и обострение заболевания у взрослых с эозинофильной астмой. AMG 317 является моноклональным антителом, направленным на рецепторы к ИЛ-4, оно блокирует связывание ИЛ-4 с его рецептором, а также ингибирует сигнал трансдукции ИЛ-13. У взрослых с умеренной и тяжелой астмой AMG 317 производит значительное клиническое улучшение только в подгруппе с отсутствием контроля заболевания.
Dupilumab — одна из последних разработок анти-ИЛ-4-терапии, воздействует на альфа-субъединицу рецептора ИЛ-4. Его применение у больных с эозинофильной астмой вследствие ингибирования как ИЛ- 4 и ИЛ-13 сопровождается значительным сокращением обострений БА и улучшением функции легких у взрослых с персистирующей астмой, отменой бета-агонистов и уменьшением дозы ингаляционных ГКС.
ОС000459 — оральный антагонист CRTH2 (хемоаттрактант рецептор-гомологичной молекулы Th2-xeлпeров). В рандомизированном двойном слепом исследовании (фаза II клинических исследований) у взрослых с умеренной персистирующей астмой применение орального антагониста CRTH2 сопровождалось улучшением функции легких, купированием ночных симптомов и улучшением качества жизни по сравнению с плацебо.
MEDI-528 — анти-ИЛ-9-антитела. Применение данного препарата продемонстрировало тенденцию к улучшению показателей контроля у взрослых с легкой и умеренной астмой, а также протективный эффект против бронхоспазма.
Возможными мишенями при разработке новых подходов в лечении БА являются молекулы TSLP, ИЛ-25 и ИЛ-33, которые продуцируются эпителиальными клетками дыхательных путей в ответ на воздействие аллергенов или вирусных триггеров, поэтому рассматриваются в качестве возможных мишеней при создании новых подходов влечении астмы.
Терапия, ориентированная на нейтрофильное воспаление. Нейтрофильное воспаление при БА ассоциировано с интерлейкинами ИЛ-17 и ИЛ-23. Secukinumab — анти-ИЛ-17-антитела — в настоящее время проходит II этап клинических исследований.
Следует отметить, что национальные и международные согласительные документы рекомендуют ступенчатый подход для достижения и поддержания контроля БА. Переход на следующую или предыдущую ступень может быть осуществлен через определенное время в зависимости от тяжести БА, на фоне оценки уровня контроля заболевания при регулярном наблюдении врача.
Достижению контроля при атопической БА способствует проведение аллерген-специфической иммунотерапии причинно-значимыми аллергенами и снижение их уровня в окружении больного.
Осуществление мониторинга, выполняемого при БА у детей, включает исследование функций внешнего дыхания и концентрации оксида азота в выдыхаемом воздухе, оценку реактивности бронхов.
Достижению и поддержанию контроля астмы способствует реализация образовательных программ для родителей и больных астмой детей.
В случае возникновения приступов БА проводится ингаляционная терапия бета-2-агонистами короткого действия или комбинированными препаратами (Беродуал), дозированными ингаляторами или через небулайзер. При тяжелых приступах проводится лечение ингаляционными и системными ГКС (per os или парентерально). При астматическом статусе эффективна инфузионная терапия Эуфиллином и ГКС.
Несмотря на наличие широкого спектра препаратов для базисной противовоспалительной терапии и препаратов для неотложной помощи, сохраняется проблема неконтролируемого или плохо контролируемого течения бронхиальной астмы, что обусловливает потребность в разработке дополнительных диагностических и терапевтических подходов.
В этой связи для оптимизации патогенетической терапии бронхиальной астмы в настоящее время проводится работа по совершенствованию противовоспалительных препаратов имеющихся классов и их сочетаний. Кроме того, ведется поиск принципиально новых подходов к терапии астмы, в том числе с учетом фенотипов и эндотипов болезни, включая создание и внедрение в практику лекарственных препаратов антицитокинового и антимедиаторного действия.
Есть надежда, что по мере детализации знаний о молекулярных характеристиках эндотипов астмы и внедрения в практику биомаркеров, позволяющих диагностировать фенотипы и эндотипы болезни, а также мониторировать уровень контроля, будет реализован персонализированный подход в назначении индивидуальной терапии каждому конкретному пациенту.
источник
Патогенез бронхиальной астмы прежде всего определяется аллергической природой болезни. Характерны в этом отношении внезапное начало приступа и часто неожиданное самопроизвольное его прекращение, а также патоморфология астмы. Более или менее ясными представляются непосредственные механизмы приступа и, в частности, сужение просвета или обтурация бронхов, обусловленные спазмом бронхиальной мускулатуры, обильным секретом слизистой бронха, отеком последней. Последовательность, так же как и степень развития каждого из этих механизмов, и их патогенетическое значение могут быть различными и обусловливать индивидуальные особенности клинической картины в каждом отдельном случае. Спорными продолжают оставаться вопросы о роли гистамина, инфекции, а также нервной системы в патогенезе бронхиальной астмы и других аллергических заболеваний. Dale u i.aidlow (1910) при внутривенном введении морской свинке гистамина получили весьма сходную с анафилактическим шоком клиническую картину острого вздутия легких и асфиксии. На основе указанных экспериментальных данных, Biedl и Kraus считали, что образующийся во время анафилактического шока гистамин и представляет собой анафилактический токсин, непосредственно действующий на бронхиальную мускулатуру (Hossey, Crussiani, Koessler, Lewis и др.). В дальнейшем выяснилось, что при всем сходстве анафилактического и гистаминового шока у морской свинки имеются и весьма существенные различия между ними и, в частности, не вполне идентичные гистологические изменения в легких, в частности, отсутствие эозинофильной инфильтрации стенки бронхов, а также эозинофилов в содержимом просвета бронхов при гистаминовом шоке, различная эффективность антигистаминовых препаратов, преобладание спазма мускулатуры бронхов при гистаминовом шоке и отека слизистой при анафилактическом и т. д. На основе обширных экспериментальных исследований Фрибель (Friebel, 1955) пришел к выводу, что гистамин может играть лишь некоторую (не доминирующую) роль как один из токсических продуктов анафилактической реакции в патогенезе бронхиальной астмы, и значение гистаминовой теории аллергии не следует расширять.
Большое влияние на возникновение и течение бронхиальной астмы оказывает инфекция. Первый приступ нередко возникает на фоне пневмонии, гриппа, ангины или другой интеркуррентной инфекции, или еще чаще вслед за ними.
В дальнейшем бронхиальная астма может неизменно рецидивировать в связи с указанными заболеваниями. В возникновении бронхиальной астмы играет роль также хроническая очаговая инфекция в миндалинах, придаточных пазухах, зубах, бронхах, желчном пузыре и т. д. Тем не менее инфекция не имеет самодовлеющего значения при бронхиальной астме. В пользу правомерности такого суждения говорят следующие факты:
- 1) указанными инфекционными заболеваниями страдает значительная часть населения, между тем лишь в отдельных случаях последние сопровождаются бронхиальной астмой;
- 2) бронхиальной астмой болеют под влиянием аллергенов, не имеющих ничего общего с инфекцией (профессиональная астма, сонная астма, нутритивная и др.), при отсутствии каких-либо указаний на инфекцию;
- 3) наиболее близкая к бронхиальной астме человека классическая экспериментальная модель (анафилактический шок у морской свинки) воспроизводится без привлечения инфекционного компонента;
- 4) возможность получения модели бронхиальной астмы в условиях какой-либо экспериментальной инфекции на животных не известна и т. д.
Роль инфекции в патогенезе бронхиальной астмы и других аллергических заболеваний можно представить следующим образом:
- 1) связанное с инфекцией поражение слизистых оболочек способствует развитию повышенной чувствительности к адекватным аллергенам;
- 2) инфекция может легче проникнуть через измененные вследствие аллергии слизистые оболочки;
- 3) инфекционный очаг может играть роль источника сенсибилизации (сенсибилизация организма продуктами метаболизма патогенной флоры, пептидами — промежуточными продуктами распада белка макроорганизма в очаге, антигеном, возникающим в процессе взаимодействия между макро- и микроорганизмом и т. д.).
Очаг инфекции может у больного бронхиальной астмой являться лишь сопутствующим заболеванием и одновременно обусловливать приступы, являясь рефлексогенной зоной в отношении бронхиальной мускулатуры. В пользу последнего варианта свидетельствует прекращение приступов в некоторых случаях непосредственно после тонзиллэктомии, удаления кариозного зуба с гранулемой, холецистэктомии и т. п.
Неврогенная теория бронхиальной астмы возникла уже у самых истоков развития учения о ней. Клинические наблюдения над влиянием эмоций на возникновение и течение приступов бронхиальной астмы, эффективность психотерапии в некоторых случаях, преобладание приступов в ночное время, а также непосредственное участие вегетативной иннервации в механизме пароксизмов бронхиальной астмы послужили основанием для трактовки последней как невроза, психоневроза и т.п. вплоть до утверждений о существовании особой формы так называемой психогенной бронхиальной астмой. Учение И.П. Павлова о высшей нервной деятельности, целостности организма, единстве организма и среды, теория нервизма Боткина—Павлова позволили ближе подойти к пониманию роли нервной системы, и ряд ранее известных фактов получил обоснованное научное объяснение.
Так, давно описанный Мекензи (Mackenzie) случай (у женщины, страдавшей бронхиальной астмой на почве повышенной чувствительности к запаху роз, возник приступ в тот момент, когда она увидела бумажную розу) получил исчерпывающее объяснение в учении И.П. Павлова об условных рефлексах. Преобладание приступов в ночное время, во время сна стало понятным в свете павловских представлений о взаимоотношении коры и подкорки в смысле положительной индукции последней в условиях активного торможения коры (физиологические основы сна) и т.д.
Б.Б. Коган наблюдал и описал ряд случаев, позволяющих рассматривать эмоции как корковые импульсы, которые могут играть роль как пусковых, так и защитных, механизмов при бронхиальной астме. У одной больной (врача) впервые возник приступ бронхиальной астмы, когда она, будучи студенткой, курировала больного бронхиальной астмой. В другом случае у больного, находившегося в течение двух недель в астматическом состоянии, последнее купировалось непосредственно после сообщения о пожаре на предприятии, которым он руководил.
Иллюстрацией благоприятного влияния творческой эмоции может служить драматический актер, страдающий в течение ряда лет бронхиальной астмой, у которого приступы не только никогда не возникали по время игры на сцене, но, наоборот, участие в спектаклях или репетициях неизменно купировало приступы. Изучение 12 больных бронхиальной астмой, у которых первый приступ возник в условиях психической травмы, позволило во всех случаях установить у них в анамнезе другие аллергические заболевания пли аналогичные указания в наследственности. Если к этому добавить, что попытки вызвать суггестивным путем приступ бронхиальной астмы приводит к положительным результатам лишь у больных бронхиальной астмой в период ремиссии и не удается вызвать приступ у здоровых лиц (П. К. Булатов), то вряд ли правомерно признавать существование чисто «психогенной» астмы. Кроме того, бронхиальная астма, возникающая под влиянием психогенных воздействий, купируется обычными спазмолитическими средствами и в дальнейшем приобретает обычное течение.
Аналогичные наблюдения Б.Б. Коган над влиянием неврогенных факторов на возникновение и течение других аллергических заболеваний (сенной лихорадкой, мигренью), а также хорошо известное появление крапивницы под влиянием эмоций позволяет отнести все, что было сказано о роли нервной системы в патогенезе бронхиальной астмы, и к аллергическим заболеваниям вообще. Исследования Метальникова, доказавшего возможность получения анафилактической реакции у кроликов в порядке выработки условного рефлекса, являются весьма важным экспериментальным подтверждением роли центральной нервной системы в патогенезе аллергии.
источник
Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему: Разработка краткосрочной безадъювантной модели экспериментальной IgE-зависимой бронхиальной астмы с использованием аллергена пыльцы тимофеевки
Автореферат диссертации по медицине на тему Разработка краткосрочной безадъювантной модели экспериментальной IgE-зависимой бронхиальной астмы с использованием аллергена пыльцы тимофеевки
Крючков Николай Александрович
Разработка краткосрочной безадъювантной модели
экспериментальной ^Е-зависимой бронхиальной астмы с использованием аллергена пыльцы тимофеевки
14 00 36 — аллергология и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Работа выполнена в ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России»
кандидат медицинских наук М.Р. Хаитов
доктор медицинских наук, профессор Б.В. Пинегин доктор медицинских наук, профессор Т.И. Гришина
Российский государственный медицинский университет
Защита диссертации состоится «¿^»Селмм^ц. 2008 г в часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208 017 01 в ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России» по адресу. 115478, г. Москва, Каширское шоссе, дом 24, корпус 2. Тел/Факс: (495) 61710-27
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России»
Автореферат разослан « >> аЛг^смшХ. 2008 г
Ученый секретарь Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций доктор медицинских наук
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. К настоящему времени накоплен немалый объем знаний о причинах возникновения и закономерностях развития бронхиальной астмы (БА) — одного из наиболее распространенных хронических неинфекционных заболеваний человека. Вплоть до начала 80-х годов XX века основным способом изучения этой нозочогии были исследования с участием людей [GINA, 2006, Faul JL, 1997; Roche W.R., 1998] Благодаря им, в частности, удалось выявить патогенетическое значение хронического аллергического воспаления в ткани легких и связь большей части случаев БА с гиперпродукцией IgE-антител Однако, неустранимые этические и технические ограничения, свойственные такого рода исследованиям, не позволяли ответить на многие вопросы Это обстоятельство, а также трудности в создании новых классов противоастматических лекарственных средств, стимулировали поиск подходов к воспроизведению признаков заболевания у животных Оказалось, что введение аллергенов по определенным схемам приводит к развитию так называемой экспериментальной бронхиальной астмы (ЭБА) у крыс, морских свинок, овец, кроликов, собак, кошек, свиней и приматов [Torres R, 2005] Важно подчеркнуть, что у каждого из перечисленных млекопитающих удается воспроизвести свой спектр признаков астмы, обязательными из которых являются спонтанная или индуцированная бронхиальная гиперреактивность, высокий уровень IgE-антител в крови, типичные морфологические изменения в ткани легких и изменения клеточного состава бронхоальвеолярного ла-важа Бурное развитие этого научного направления началось в середине 1990-х годов с момента первого описания модели БА на лабораторных мышах [Kung Т Т., 1994] Мышиная ЭБА отличается высоким уровнем сопоставимости с патологическими признаками заболевания человека, а сами животные хорошо доступны для изучения в связи с наличием разработанных подходов селекции, генной инженерии, молекулярной биологии, лаборатор-но-инструментальной диагностики, Помимо прочего важным оказалось и удобство работы с мышами, обусловленное относительно низкими затратами
на их содержание и питание и коротким репродуктивным циклом [Sugita М, 2003, Torres R., 2005].
Бы то показано, что разные линии мышей различаются способностью реагировать на аллергены и развивать воспаление в тканях Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что одной из наиболее реактивных является чистая линия BALB/c, в то время как, например, С57ВЬ/6-мыши сенсибилизируются и провоцируются значительно хуже [Литвин Л С , 2006]
Для получения ЭБА наиболее часто используется овальбумин (OA) -аллерген с хорошо известными структурой и свойствами. К настоящему моменту разработано несколько схем моделирования. Наиболее часто на первом этапе проводится 2-3-кратное интраперитонеальное введение аллергена через 2-4 дня в дозе по 10 мкг/мышь в комбинации с гидроксидом алюминия Последний используется в качестве адъюванта для усиления Тх2-ответа и аллергического воспаления в дыхательных путях Однако, как выяснилось, введение OA в комбинации с алюмом вызывает появление обширных лимфоци-тарно-эозинофильных инфильтратов вокруг крупных бронхов, а инъекции монопрепарата аллергена индуцируют образование воспалительных очагов преимущественно около мелких бронхов [Epstein М М., 2006] Кроме того, не предполагается влияния адекватного по мощности адъюванта в процессе «естественной» сенсибилизации человека Поэтому все больший интерес привлекают безадьювантные модели, точнее имитирующие патогенез бронхиальной астмы и, в дополнение, позволяющие изучать влияние различных им-муномодулирующих агентов на маркеры заболевания [Крючков Н.А, 2008, Литвин Л С, 2007]. Тем не менее, воспроизведение ЭБА без применения адъювантов сопряжено со значительными трудностями и необходимостью подбора доз и кратности введения аллергена, достаточных для развития аллергического ответа, но не приводящих к развитию иммунологической толерантности В нашей стране выполнена серия работ, показавших действенность 7-кратных ежедневных или повторяющихся через день внутрибрю-шинных инъекций 10 мкг/мышь овальбумина [Литвин Л.С , 2007]. Через 2-3
недели после окончания интраперитонеальных или подкожных введений проводится провокация интраназальным введением OA Повторный контакт с антигеном в условиях предрасположенности к Тх2-ответу вызывает развитие иммунного воспаления, IgE-переключение, эозинофильную инфильтрацию стенок бронхиального дерева и после многократной экспозиции приводит к бронхиальной гиперреактивности
В последние годы для модечирования БА стали использоваться причинно-значимые аллергены, в первую очередь, пыльцевые и пылевые [Крючков H А, 2008, Kryuchkov N А, 2007, Kumar R.K, 2002; Torres R, 2005], вызывающие аллергическую патологию у человека в естественных условиях Данный подход особенно актуален в связи с необходимостью разработки новых технологий и схем антиген-специфической терапии (АСИТ) и предварительного изучения ее эффективности и безопасности на доклинических этапах Принципы воспроизведения ЭБА с использованием причинно-значимых алчергенов и овальбумина аналогичны Как правило, вначале проводится системная сенсибилизация, а после ее окончания — провокация путем доставки аллергена в воздухоносные пути В качестве аллергена могут выступать экстракты пыльцы ветроопыляемых растений и домашней пыли, а также экстрагированные или рекомбинантные сенсибилизирующие компоненты Эффективные дозы препаратов и схемы их введения различаются, однако предпочтительнее использовать малые количества аллергенов в отсутствие адъю-вантов Уже получены мышиные модели с сенсибилизацией к аллергенам домашней пыли [Ahn J H, 2007, McKinley L, 2004], маслины [Conejero L., 2007], пыльцы амброзии [Wild J S , 2000] и березы [Daniel С , 2006] Однако перечень причинно-значимых сенсибилизирующих агентов, изученных на предмет способносш вызывать ЭБА-подобные изменения, пока чрезвычайно ограничен
Цель работы: разработать и охарактеризовать краткосрочную безадъ-ювантную модель бронхиальной астмы на лабораторных мышах линии
ВАЬВ/с с использованием аллергенного экстракта пыльцы тимофеевки полевой
1 Разработать оптимальную схему моделирования экспериментальной бронхиальной астмы у мышей путем введения экстракта пыльцы тимофеевки в отсутствие адъюванта
2. Изучить динамику накопления аллерген-специфических гомоцитотроп-ных 1§Е-антител в крови мышей в ходе моделирования бронхиальной астмы
3. Провести оценку гистологических изменений легких мышей при моделировании БА
4 Разработать и провести первичную проверку применимости полуколичественной системы анализа гистологических изменений легких мышей с экспериментальной бронхиальной астмой
5 Оценить изменения относительного клеточного состава бронхо-альвеолярного лаважа у мышей с экспериментальной бронхиальной астмой.
6 Оценить изменения лейкоцитарной формулы периферической крови у мышей с экспериментальной бронхиальной астмой
7 Провести пневмотахографическую оценку функции внешнего дыхания у мышей с экспериментальной бронхиальной астмой
Научная новизна. Впервые в мире разработана и охарактеризована краткосрочная модель ¡^Е-зависимой бронхиальной астмы с использованием аллергенного экстракта пыльцы тимофеевки полевой у мышей без использования адъюванта Полученная модель ЭБА характеризуется развитием ранней и поздней фазы аллергического ответа в дыхательных путях, повышением аллерген-специфических 1§Е-антител в периферической крови, выраженной гиперреактивностью бронхов на воздействие неспецифического бронхо-констриктора метахолина. Данные признаки адекватны патологическим из-
менениям, характерным для острого воспаления при атопической бронхиальной астме человека
Впервые предложен метод полуколичественного анализа гистологических изменений легких мышей при моделировании бронхиальной астмы
Практическая значимость. Разработанная модель БА на лабораторных мышах может использоваться для оценки эффективности и безопасности потенциальных лекарственных средств или их форм в процессе лечения и профилактики заболевания на доклиническом этапе, Особое значение имеет возможность применения данной модели для нахождения новых подходов к антиген-специфической терапии модифицированными аллергенами пыльцы тимофеевки
Предложенная модель может применяться и при изучении патогенетических механизмов развития бронхиальной астмы
Полученные данные могут быть использованы в образовательном процессе на додипломном этапе высшего медицинского образования и в учебных программах повышения квалификации специалистов по аллергологии и иммунологии
Апробация работы. Результаты исследования докладывались на VIII Российском конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (27-29 июня 2007 г., Москва, Россия), И Международном конгрессе «Иммунитет и болезни» (10-14 сентября 2007 г , Москва, Россия) XXVII конгрессе Европейской Академии Аллергологии и Клинической Иммунологии (7-11 июня 2008 г, Барселона, Испания). Основные результаты диссертационной работы отражены в 6 публикациях
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа построена по традиционному плану, изложена на 125 страницах машинописного текста Состоит из введения, обзора литературы, разделов, описывающих материалы и методы исследований, результаты, обсуждения полученных результатов и выводов Диссертация иллюстрирована 11 таблицами, 26 рисунками,
включая фотографии. Список использованной литературы включает 153 источника из них 16 отечественных и 137 зарубежных
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Собственные экспериментальные данные были получены с использованием самок мышей линии ВАЬВ/с весом 18-20 г, полученных из питомника ГУНЦБМТ РАМН Постановку реакции пассивной кожной анафилаксии проводили на беспородных белых крысах-самцах весом 200-280 г, полученных из питомника РОНЦ РАМН. Вся работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с приказом МЗиСР РФ №267 от 19 06 2003 г «Правила лабораторной практики в Российской Федерации» и «Положением об этическом отношении к лабораторным животным ГНЦ Института иммунологии ФМБА России» В настоящей работе использовался лиофилизиро-ванный экстракт пыльцы тимофеевки полевой (получен и паспортизирован в лаборатории моделирования иммунологических процессов, зав — к м н А И Мартынов, контрольное определение массовой доли азота выполнено в табо-ратории микроанализа НИИ Элементорганических соединений им. А Н. Несмеянова РАН, зав — к х.н А Г Буяновская)
1.1. Схема краткосрочной модели ЭБА. Животных опытной группы (21 мышь) иммунизировали внутрибрюшинно 20 мкг/мышь экстракта пыльцы тимофеевки (из расчета по содержанию белка) в 0,5 мл физиологического раствора по схеме 7 раз через день. Через три недели после окончания интра-перитонеальных инъекций проводили 8-кратное ежедневное интраназальное введение аллергенного экстракта (вб) в дозе 500 мкг/мышь (в объеме 50 мкл) Контрольная группа (21 мышь) получала ложные иммунизацию и провокацию внутрибрюшинные и интраназальные введения физиологического раствора по вышеизложенной схеме Забор крови из ретроорбитального синуса проводили на 27 и 43 дни эксперимента Уровень анти-Об-^Е-антител в пуловых сыворотках определяли методом пассивной кожной анафилаксии. На 42-е сутки пневмотахографически определялись амплитуда и период ды-
хания (у 7 животных контрольной и опытной группы) На 43-й день эксперимента проводили забор БАЛ (у 7 мышей каждой группы) и легких (также у 14 животных) Схема эксперимента представлена на рис 1
# — забор БАЛ и легких для гистологического исследования
Рисунок 1, Схема краткосрочной модели экспериментальной бронхиальной астмы на аллерген пыльцы тимофеевки
1.2. Определение awra-G6 IgE-антител. Постановку реакции пассивной кожной анафилаксии (ПКА) проводили, руководствуясь описанной ранее методикой [Ovary Z, 1977] Результаты представляли в форме двоичного логарифма величины, обратной титру гомоцитотропных Об-специфических IgE-антител в пуловых мышиных сыворотках.
1.3. Оценка клеточного состава периферической крови. Проводили забор периферической крови из ретроорбитального синуса Каплю полученной крови наносили на предметное стекло и получали мазок по методике, описанной в руководстве [Кисели Д., 1962] После высушивания проводили фиксацию материала в метиловом спирте в течение 10-15 минут. Затем мазки окрашивали азуром и эозином по Романовскому. В полученном препарате
под увеличением светового микроскопа 10×100 подсчитывали относительное содержание лейкоцитов (лейкоцитарную формулу) на 200-300 клеток, ней-трофилов, моноцитов, лимфоцитов и эозинофилов по известным морфологическим критериям [Никитин В М, 1949].
1.4. Получение и оценка клеточного состава бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ). Под эфирным наркозом животных умерщвляли, после чего препаровальными иглами закрепляли на предметном столике брюшной поверхностью вверх Кожные покровы передней части тела мышей обрабатывали 70% этиловьм спиртом Выполняли последовательные разрезы кожи, подкожной клетчатки, поверхностных фасций от нижнегрудинной области до верхнего отдела шеи, отсепаровывали мышцы, выделяли трахею В переднюю поверхность средней трети трахеи вводили затупленную инъекционную иглу Затем через нее шприцем вводили 0,5 мл предварительно подготовленной теплой среды (RPMI 1640, 10% эмбриональная телячья сыворотка, 0,2% этилендиаминтетраацетат натрия)-Шприцем отсасывали введенную в легкие жидкость, перенося ее в отдельные стерильные пробирки объемом 1,5 мл типа Eppendorf Процедуру введения и забора среды из легких повторяли дважды, получая, таким образом, 1 мл клеточной взвеси от каждой мыши
Полученный БАЛ центрифугировали при 150g в течение 15 минут Сливали надосадочную жидкость, клеточный осадок ресуспендировали и наносили на предметное стекло Готовили и окрашивали мазок по методике, использованной при получении цитологических препаратов периферической крови С помощью иммерсионной световой микроскопии (увеличение 10×100) подсчитывали процентное содержание моноцитов, лимфоцитов, ней-трофилов, эозинофилов и эпителиоцитов бронхоальвеолярного тракта на 300400 клеток мазка.
1.5. Приготовление и гистологическое исследование микропрепаратов легких. Некропсия мышей методом шейной дислокации осуществлялась под эфирным наркозом Передняя поверхность грудной клетки обрабатывалась 70% этиловым спиртом Производились последовательные разрезы
кожи, поверхностных фасций, мышц. По правой парастернальной линии хирургическими ножницами разъединялись грудино-ключичные сочленения Затем поэтапно выделялись правое и левое легкие Полученные органы помещались в 10 мл флаконы с 10% раствором формалина. После длительной фиксации в формалине ручным способом проводили обезвоживание, проводку и заливку образцов в парафин Микротомированием парафиновых блоков получали срезы легких толщиной 5-6 мкм Полученные препараты окрашивались гематоксилин-эозином и фиксировались в пихтовом масле Гистологическое исследование микропрепаратов легких мышей осуществляли на световом микроскопе при увеличении 10×15 раз Помимо качественной проводили полуколичественную оценку воспалительных изменений и ремодели-рования бронхов (по методике [Ептз Б Р., 2005], с изменениями) При этом выраженность того или иного признака оценивалась в баллах (порядковой шкале) Приготовление микропрепаратов легких лабораторных мышей и их оценка проводилась в лаборатории моделирования иммунологических процессов ГНЦ Института иммунологии ФМБА России (зав — к м.н А И. Мартынов) Фотосъемка срезов легких выполнялась в лаборатории стандартизации групп крови Гематологического научного центра РАМН (зав — проф. С И. Донсков, ст науч сотрудник — к б н И.В Дубинкин)
1.6. Оценка бронхиальной гиперреактивности. Параметры ФВД регистрировались с помощью пневмотахографической установки, предоставленной нам Отделом токсикологии Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения (г. Москва). Принцип регистрации базировался на записи кривой дыхательных движений передней брюшной стенки мыши Животных помещали в пенал и фиксировали с помощью подвижной задней стенки для ограничения локомоторной активности После периода адаптации (30 с — 1 мин) производили серию записей пневмотахограмм при постоянной скорости движения бумаги 10 мм/с и коэффициенте усиления напряжения входного сигнала полиграфа (10 мВ/см) Регистрацию параметров функции внешнего дыхания проводили до и после введения неспецифическо-
го бронхоконстриктора метахолина в хвостовую вену мыши (через 1, 3 и 5 мин) На пневмотахограммах первично оценивались амплитуда и период дыхательных актов в эпохах записи не менее 30 с. При этом, анализу подвергался временной интервал, в течение которого амплитуда сигнала варьировала минимально (до 10%) Измеряли и рассчитывали следующие итоговые для каждого животного показатели среднюю амплитуду дыхания по многократным измерениям амплитуд волн на пневмотахограме (мм и мВ) за эпоху анализа, среднюю продолжительность дыхательных актов по многократному измерению расстояний между вершинами двух ближайших волн на пневмо-тахограмме (мм и мс), отношение средней амплитуды дыхания через 1, 3 и 5 мин после введения метахолина к средней амплитуде дыхания до введения бронхоконстриктора, принимаемого за 100% (%), отношение средней продолжительности дыхательных актов через 1, 3 и 5 мин после введения метахолина к исходному значению этого параметра до введения метахолина, принимаемого за 100% (%),
1.7. Алгоритм статистического анализа. Проводился описательный анализ количественных и порядковых данных с расчетом значений среднего арифметического (М), стандартного отклонения (SD), 95% доверительного интервала (ДИ) для среднего, медианы (Med) и интерквартильного размаха (IQR) для всех экспериментальных групп Сравнение достоверности различий количественных и порядковых признаков между группами проводилось по следующему алгоритму После проверки допущений для применения параметрического многофакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями (GLM), проводился расчет статистической значимости модели по критерию След Пилая В случае обнаружения достоверных различий при уровне альфа ошибки 0,05 проводилось межгрупповое сравнение значений признаков с использованием t-критерия Стьюдента или статистики Манна-Уитни (в зависимости от характера выборочных распределений, равенства дисперсий и других допущений) С учетом поисковой специфики исследования, поправки на множественные сравнения не проводилось Для оценки зна-
чимости различий экспериментальных групп по значениям полуколичественных шкал патоморфологических изменений легких дополнительно применялся критерий Хи-квадрат, А результаты, полученные в ПКА, также обрабатывались с учетом специального эмпирического критерия, предложенного Fox DA [Fox DA, 1976] Статистический анализ полученных данных проводился с использованием программного пакета SPSS 13.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Через 14 дней после завершения фазы сенсибилизации титры анти-Ge антител в реакции ПКА не определялись и были ниже пороговых 1 4 Однако после проведения провокационных введений G6 было зафиксировано выраженное повышение концентрации специфических IgE в пуловой сыворотке крови мышей опытной группы (до величины 1 128), подтвержденное параллельной постановкой реакции ПКА на 4 крысах (соответствующие уровни антител. 7, 7, 7, 6). Для сравнения, в контрольной группе ни на 27-й, ни на 43-й день aHTH-G6-IgE не обнаруживались Многомерный двухфакторный анализ (GLM) показал достоверность модели (р Крючков, Николай Александрович :: 2008 :: Москва
1.1. Бронхиальная астма человека.
1.1.1. Влияние на общественное здоровье.
1.1.2. Клетки и медиаторы воспаления.
1.1.4. Гистологические изменения и ремоделирование дыхательных путей.
1.1.5. Генетические факторы предрасположенности.
1.1.6. Аллергены и другие внешние факторы.
1.2. Моделирование бронхиальной астмы.
1.1.6. Использование животных для моделирования бронхиальной астмы.
1.2.3. Овальбуминовые модели на лабораторных мышах.
1.2.4. Модели на лабораторных мышах с использованием причинно-значимых аллергенов.
1.2.5. Лабораторно-инструментальные методы при моделировании бронхиальной астмы.
1.3. Преимущества и недостатки мышиных моделей бронхиальной астмы.
Глава 2. Материалы и методы.
2.2. Аллергены, реагенты и расходные материалы.
2.3. Схема иммунизации лабораторных мышей для определения аллергенности экстракта пыльцы тимофеевки.
2.4. Схема пилотного эксперимента для определения оптимальной сенсибилизирующей дозы аллергена пыльцы тимофеевки.
2.5. Схема эксперимента для проверки эффективности сниженной интраназаль-ной дозы экстракта пыльцы тимофеевки.
2.6. Схема эксперимента для подтверждения сенсибилизирующей активности экстракта пыльцы тимофеевки в дозе 20 мкг/мышь (краткосрочная модель экспериментальной бронхиальной астмы).
2.7. Определение антиген-специфических ^Е-антител методом пассивной кожной анафилаксии.
2.8. Оценка клеточного состава периферической крови.
2.9. Методика получения бронхоальвеолярного лаважа у лабораторных мышей и оценка его клеточного состава.
2.10. Приготовление микропрепаратов легких и их гистологическое исследование
2.11. Пневматахографическая оценка функции внешнего дыхания мышей при введении неспецифического бронхоконстриктора.
2.11.1. Пневматахографическая установка.
2.11.2. Регистрация и анализ пневматахограмм.
2.12. Методы статистического анализа.
Глава 3. Результаты собственных исследований.
3.1. Динамика образования специфических ^Е-антител при трехкратной иммунизации мышей аллергеном тимофеевки и его комбинациями с адъювантами.
3.2. Подбор оптимальной дозы аллергена пыльцы тимофеевки для моделирования экспериментальной бронхиальной астмы.
3.3. Проверка эффективности сниженной дозы экстракта пыльцы тимофеевки (250 мкг/мышь) при моделировании экспериментальной бронхиальной астмы.
3.4. Характеристика разработанной модели.
3.4.1. Динамика содержания анти-вб ^Е-антител в сыворотке крови.
3.4.2. Относительный клеточный состав периферической крови.
3.4.3. Относительный клеточный состав бронхоальвеолярного лаважа.
3.4.4. Гистологическое исследование легких.
3.4.5. Оценка функции внешнего дыхания с использованием метахолина.
Введение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Крючков, Николай Александрович, автореферат
Бронхиальная астма (БА) — одно из наиболее распространенных хронических неинфекционных заболеваний. По оценкам Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), в мире живет 300 млн. человек, болеющих астмой, а ежегодная смертность от этой патологии составляет 100-250 тыс. человек [2,18,19,27,28]. Примерно 1% от всех потерь лет жизни с поправкой на нетрудоспособность (DALY) обусловлены этой патологией. По данным поперечных исследований, в нашей стране 5,6-7,3% взрослых и 6-11% детей страдает астмой
К настоящему времени, течение БА контролируется стандартной терапией, замедляя развитие заболевания и радикально улучшая качество жизни пациентов. Однако у 10-20% больных заболевание протекает в тяжелой форме, плохо поддающейся терапевтической коррекции противовоспалительными и антибронхоконстрикторными препаратами [7].
Разработка новых подходов к лечению, диагностике и профилактике астмы остается актуальной задачей и невозможна без выяснения патогенетических механизмов развития болезни. Многочисленные исследования с участием людей, связанные, главным образом, с применением бронхоскопии и гистологического исследования материалов, полученных при биопсии и аутопсии, внесли значительный вклад в понимание проблемы. Но непреодолимые ограничения этического и технического характера не дают возможности ответить на множество вопросов, касающихся этиологии и патогенеза БА. Поэтому все более широкое применение находят биологические модели, позволяющие воспроизводить характерные признаки патологии у животных.
Уже разработаны методы индукции экспериментальной бронхиальной астмы (ЭБА) у крыс, морских свинок, овец, кроликов, собак, кошек, свиней и приматов. Использование каждого из перечисленных животных имеет свои , преимущества и недостатки [29,74,142,143]. Однако, после успешного вос-‘ произведения признаков гиперпродукции ^Е, аллерген-индуцированного воспаления дыхательных путей и гиперреактивности бронхов у лабораторных мышей, стало ясно, что именно эти млекопитающие оптимальны для моделирования БА [78,84,132,142]. И тому есть несколько причин. Во-первых, удается обеспечить высокую степень соответствия ключевых гистологических, иммунных и функциональных феноменов экспериментальной патологии и астмы человека. Во-вторых, имеются эффективные лабораторно-инструментальные методы оценки функции внешнего дыхания, иммунологических показателей и морфологических изменений у грызунов. В-третьих, хорошо отработана технология получения чистых линий, трансгенных и но-каутных мышей. В-четвертых, мыши являются удобным экспериментальным объектом по причине невысоких материально-трудовых затрат на их содержание и питание и короткого репродуктивного цикла.
Наиболее используемым аллергеном для моделирования БА является овальбумин. Этот препарат имеет хорошо изученную структуру, свойства, налажен его коммерческий выпуск, что в сочетании с невысокой стоимостью делает его доступным для рутинного применения в исследовательской практике. С целью сенсибилизации ОА вводят интраперитонеально, при этом часто комбинируя с адъювантом, например, гидроксидом алюминия (алю-мом) или неполным адъювантом Фрейнда [10,120,142]. Наиболее используемые схемы предусматривают 7-8-кратное введение через день по 10-20 мкг аллергена или 2-3-кратное через 2-4 дня по 10 мкг в комбинации с алюмом. Адъювант способствует быстрой перестройке иммунного ответа в ТЬ2напралении и развитию ярких проявлений ^Е-ответа в ущерб точности и 8 физиологичности» воспроизведения маркеров БА. Поэтому все большее место отводится безадьювантным моделям, точнее имитирующим патогенез заболевания человека [11,51].
Кроме того, резко возрос интерес к использованию в процессе индукции ЭБА так называемых причинно-значимых аллергенов, вызывающих развитие и обострение заболевания у человека. Уже получены мышиные модели с сенсибилизацией к аллергенам домашней пыли [17, 71,73,76,77,93,94], маслины [39], пыльцы амброзии [134,147,79] и березы [46]. Такой подход, помимо прочего, позволяет изучать эффективность и безопасность антиген-специфической иммунотерапии (АСИТ) на доклинических этапах. К настоящему времени отсутствуют модели ЭБА с использованием большей части клинически-значимых аллергенов. Среди последних особое значение для нашей страны имеет пыльца дикорастущих и сельскохозяйственных трав: тимофеевки, полыни, овса и др.
В России к началу 2008 была воспроизведена лишь одна модель БА -краткосрочная с использованием овальбумина, подробно описанная в нескольких русскоязычных работах [8-11]. В то же самое время, было найдено 837 зарубежных исследований, посвященных той же проблеме. Это свидетельствует о необходимости заметно активизировать отечественную исследовательскую работу в этом направлении.
Цель работы: разработать и охарактеризовать краткосрочную безадъ-ювантную модель ^Е-зависимой бронхиальной астмы у мышей с использованием экстракта пыльцы тимофеевки полевой. Задачи:
1. Изучить 1§Е-ответ мышей линии ВАЬВ/с на введение экстракта пыльцы тимофеевки.
2. Разработать оптимальную схему моделирования экспериментальной бронхиальной астмы у мышей путем введения экстракта пыльцы тимофеевки в отсутствие адъюванта.
3. Изучить динамику накопления аллерген-специфических гомоцито-тропных ^Е-антител в крови мышей в ходе моделирования бронхиальной астмы.
4. Провести оценку гистологических изменений легких мышей при моделировании БА
5. Разработать и провести первичную проверку применимости полуколичественной системы анализа гистологических изменений легких мышей с экспериментальной бронхиальной астмой.
6. Оценить изменения относительного клеточного состава бронхо-альвеолярного лаважа у мышей с экспериментальной бронхиальной астмой.
7. Оценить изменения лейкоцитарной формулы периферической крови у мышей с экспериментальной бронхиальной астмой.
8. Провести пневмотахографическую оценку функции внешнего дыхания у мышей с экспериментальной бронхиальной астмой.
Впервые в мире разработана и охарактеризована краткосрочная модель ^Е-зависимой бронхиальной астмы с использованием аллергенного экстракта пыльцы тимофеевки полевой у мышей без использования адъюванта
Впервые предложен метод полуколичественного анализа гистологических изменений легких мышей при моделировании бронхиальной астмы. Практическая значимость:
Разработанная модель бронхиальной астмы на лабораторных мышах может использоваться для оценки эффективности и безопасности потенци
10 альных лекарственных средств или их форм в процессе лечения и профилактики заболевания на доклиническом этапе. Особое значение имеет возможность применения данной модели для нахождения новых подходов к антиген-специфической терапии модифицированными аллергенами пыльцы тимофеевки.
Предложенная модель может использоваться и при изучении патогенетических механизмов развития бронхиальной астмы.
источник