Меню Рубрики

Биомаркеры при бронхиальной астме

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.05) на тему: Биомаркеры воспаления у больных бронхиальной астмой в индуцированной мокроте и выдыхаемом воздухе

Автореферат диссертации по медицине на тему Биомаркеры воспаления у больных бронхиальной астмой в индуцированной мокроте и выдыхаемом воздухе

На правах рукописи УДК: 616.248-073

Дулина Тамара Рамазановна

ии3461372 БИОМАРКЕРЫ ВОСПАЛЕНИЯ У БОЛЬНЫХ

БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ В ИНДУЦИРОВАННОЙ

МОКРОТЕ И ВЫДЫХАЕМОМ ВОЗДУХЕ

14.00.05 — Внутренние болезни 14.00.43 — Пульмонология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава»

Доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Соколов Евгений Иванович

Кандидат медицинских наук Зыков Кирилл Алексеевич

Доктор медицинских наук, профессор Григорьев Юрий Геннадиевич Доктор медицинских наук, профессор Федорова Татьяна Алексеевна

ФГУ Российский научный центр восстановительной медицины и курортологии Минздравсоцразвитш России

Защита состоится /^г_2009 года в -/3 часов

на заседании диссертационного совета Д208.041.01 при ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» (127437, г.Москва, ул. Делегатская, д.20/1.).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного медико-стоматологического университета (127206, Москва, ул. Вучетича, д. 10а).

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Общая характеристика работы Введение Актуальность

Бронхиальная астма (БА) является одним из самых частых заболеваний респираторного тракта во всех возрастных группах (А.Г. Чучалин, 2007 г.). БА — прежде всего хроническое воспалительное заболевание, поэтому большая роль отводится методам изучения воспаления. В совместном докладе Национального института сердца, легких, крови (США) и Всемирной организации здравоохранения «Бронхиальная астма. Глобальная стратегия», опубликованном в 1993 году, в рекомендациях для дальнейших исследований неоднократно подчеркивается необходимость в развитии надежных неинвазив-ных тестов, которые могли бы отражать степень воспаления. Установлено, что к регуляции клеточных функций, в том числе к патогенезу бронхиальной астмы (БА) имеет отношение оксид азота (N0). Содержание оксида азота в выдыхаемом воздухе может быть измерено с помощью хемилюминесцентно-го метода. Повышение концентрации оксида азота в выдыхаемом воздухе отражает степень аллергического воспаления в бронхах и в настоящее время признано одним из маркеров БА (А.Г. Чучалин, 2000). Вместе с тем, указанный неинвазивный метод пока еще дорог и малодоступен.

В последнее время большое внимание уделяется методам неинвазив-ной оценки наличия и выраженности воспаления в бронхиальном дереве, к которым относится метод индуцированной мокроты (ИМ). К достоинствам метода ИМ относятся: неинвазивность, доступность и дешевизна, отсутствие противопоказаний и сколько-нибудь выраженных побочных эффектов, возможность оценить участвующие в воспалении клеточные элементы, провос-палительные цитокины и другие растворимые компоненты, а также метаболиты оксида азота. Изучение цитологического состава и содержания растворимых компонентов ИМ может дать возможность не менее оперативно и достоверно судить об активности патологических процессов в дыхательных путях, чем эндоскопическое исследование бронхов со взятием биопсии и

бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ). Вместе с тем, работы, посвященные сравнительному анализу неинвазивных методов исследования при бронхиальной астме относительно малочисленны, а их результаты часто противоречивы, что послужило основанием для данного исследования.

Изучить биомаркеры воспаления в индуцированной мокроте и выдыхаемом воздухе у взрослых и детей с бронхиальной астмой и оценить их информативность для диагностики заболевания и оценки эффективности проводимой терапии.

1. Оценить безопасность и информативность метода индуцированной мокроты для оценки интенсивности воспаления дыхательных путей у больных БА различной степени тяжести.

2. Провести сравнительное изучение цитологических и биохимических показателей ИМ и БАЛ.

3. Дать патогистологическое описание бронхобиоптатов и провести морфо-метрический анализ стенки бронха в норме и при бронхиальной астме.

4. Изучить содержание N0 в выдыхаемом воздухе, концентрацию нитратов в ИМ и плазме крови.

5. Провести корреляционный анализ цитологических, морфометрических показателей, концентрации эйкозаноидов, а также показателей N0 и нитратов при бронхиальной астме у детей и взрослых.

Доказано, что характеристика клеточного состава ИМ одинаково информативна у больных БА взрослого и детского возраста. Выявлена корреляционная зависимость цитологических показателей ИМ от степени тяжести БА и проводимой терапии. При сравнительном изучении у больных БА цитологических и биохимических показателей индуцированной мокроты и бронхоальвеолярного лаважа установлено, что они дополняют друг друга, так как

дают адекватную оценку воспалительных изменений в различных отделах респираторного тракта.

Найдена положительная взаимосвязь между клеточным составом ИМ и содержанием оксида азота в выдыхаемом воздухе, что свидетельствует об их взаимном участии в воспалении дыхательных путей. Наличие в ИМ клеточных элементов острого воспаления, повышенное содержание N0 в выдыхаемом воздухе, выявленные патоморфологические признаки воспаления в биоптатах стенки бронха и увеличение синтеза эйкозаноидов у больных БА в стадии ремиссии заболевания указывают на персистенцию аллергического воспаления дыхательных путей. Показана возможность определения концентрации эозинофильного катионного протеина в индуцированной мокроте и выявлена положительная корреляционная взаимосвязь этого показателя с содержанием оксида азота в выдыхаемом воздухе. Установлено, что процесс усиленного эндогенного синтеза N0 повышает уровень нитратов в ИМ, не повышая их концентрацию в плазме крови. Обнаружена прямая корреляционная зависимость между концентрацией оксида азота в выдыхаемом воздухе и содержанием нитратов в ИМ, что позволяет рекомендовать использование метода изучения содержания нитратов в индуцированной мокроте при отсутствии возможности определения концентрации оксида азота в выдыхаемом воздухе.

Внедрение в широкую клиническую практику неинвазивного, безопасного и информативного метода изучения показателей индуцированной мокроты совместно с определением концентрации оксида азота в выдыхаемом воздухе дает возможность объективно оценить активность воспалительного процесса у больных БА как в период обострения заболевания, так и во время ремиссии. На этой основе может быть оптимизирован подбор противовоспалительной терапии и дальнейшая оценка ее эффективности. Использование изученных неинвазивных методов особенно оправдано при обследовании детей, страдающих бронхиальной астмой, так как исследование показателей

внешнего дыхания во время ремиссии заболевания недостаточно информативно, а многократное использование инвазивных методов диагностики невозможно.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При сравнительном изучении цитологических и биохимических показателей индуцированной мокроты и бронхоальвеолярного лаважа у больных БА установлено, что они дополняют друг друга, так как дают адекватную оценку воспалительных изменений в различных отделах респираторного тракта.

2. Повышенное содержание оксида азота в выдыхаемом воздухе и увеличение в 11 раз доли эозинофилов в индуцированной мокроте у детей, страдающих БА по сравнению со здоровыми, подтверждают персистенцию аллергического воспаления дыхательных путей в стадии ремиссии заболевания.

3. Процесс усиленного эндогенного синтеза оксида азота повышает уровень нитратов в ИМ у больных БА по сравнению со здоровыми добровольцами, что отражает выраженность воспаления, в отличие от концентрации нитратов в плазме крови, которая практически не отличается от группы сравнения и не зависит от тяжести БА.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в практику пульмонологического отделения Главного клинического госпиталя МВД России и педагогическую практику кафедры госпитальной терапии № 2 МГМСУ.

Основные положения диссертации доложены на совместном заседании кафедр факультетской терапии и профболезней МГМСУ, лаборатории пульмонологии НИМСИ МГМСУ и кафедры общей гигиены МГМСУ 26 ноября 2008 г.

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 из них опубликованная в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Самостоятельно отбирала пациентов для исследования, освоила проведение компьютерной спирометрии, получение индуцированной мокроты, ее дальнейшую обработку, выделение супернатанта, приготовление мазков индуцированной мокроты и бронхоальвеолярного лаважа, также проводила подсчет клеточных элементов в мазках, определение нитратов в супернатанте индуцированной мокроты. В ходе данного исследования самостоятельно проводила статистическую обработку данных и анализ полученных результатов.

Объем и структура диссертации

Диссертация представлена на 107 страницах, состоит из введения, 4 глав: обзор литературы, материалы и методы собственных исследований и обсуждения результатов исследования, выводов, практических рекомендаций. Диссертация иллюстрирована 8 рисунками и 9 таблицами. Библиографический указатель содержит 39 отечественных и 98 зарубежных источника. Содержание работы

Материалы и методы В исследование было включено 100 пациентов — это взрослые и дети, страдающие атопической БА. Группу сравнения составили 21 практически здоровый доброволец.

Взрослые. В исследование включались пациенты с легкой персисти-рующей, среднетяжелой персистирующей и тяжелой персистирующей атопической бронхиальной астмой. Тяжесть БА устанавливалась на основании рекомендаций СТМА, 2002 г.

В первую группу вошли пациенты с легкой персистирующей бронхиальной астмой. Группу исследуемых больных составили 18 мужчин и 7 женщин. Средний возраст больных в этой группе составил 49,3 ± 4,5 лет, средняя продолжительность заболевания — 8,2 ± 1,3 года. Во время исследования терапия включала в себя прием ингаляционных (32-агонистов длительного действия или их комбинации с ипратропиум бромидом, а также ингаляционных глю-

кокортикостероидов. Объем форсированного выдоха за 1 секунду в % от должного в этой группе пациентов составил 96,6 ±10,3.

Вторая группа состояла из пациентов, страдающих среднетяжелой персистирующей бронхиальной астмой. В нее вошли 35 человек, из которых 21 мужчина и 14 женщин. Средний возраст пациентов в этой группе составил 51,3 ± 3,8 лет, при этом средняя продолжительность болезни — 14,1 ± 3,3 лет. Проводилась терапия ингаляционными р2-агонистами длительного действия, ингаляционными антихоленергическими препаратами, ингаляционными глюкокортикостероидами (22 пациента). 13 человек получали пероральные глюкокортикостероиды, из которых 8 мужчин и 5 женщин. Объем форсированного выдоха за 1 секунду в % от должного в этой группе пациентов составил 78,7 ± 5,9.

В третью группу вошли пациенты с тяжелой персистирующей БА, из которых 15 мужчин и 5 женщин. Средний возраст больных в этой группе составил .59,4 ± 5,4 года, при этом средняя продолжительность заболевания -23,2 ± 2,2 года. Противовоспалительная терапия проводилась ингаляционными (32-агонистами длительного действия, ингаляционными антихоленергическими препаратами, ингаляционными глюкокортикостероидами. Объем форсированного выдоха за 1 секунду в % от должного в этой группе пациентов составил 74,6 ± 4,8.

Дети. В исследование были включены дети, страдающие среднетяжелой персистирующей БА в стадии ремиссии. Степень тяжести бронхиальной астмы устанавливалась на основании рекомендаций Национальной программы «Бронхиальная астма у детей. Стратегия лечения, профилактика», 1997 г. В данную группу вошли 11 мальчиков и 9 девочек. Средний возраст детей составил — 11,4 ± 1,6 лет. Длительность заболевания в этой группе — 7,5 ± 2,9 лет. Объем форсированного выдоха за первую секунду в % от должного у исследуемых детей составил 83,8 ± 10,6.

Критериями исключения пациентов из исследования являлись следующие показатели:

— наличие острого или хронического неаллергического воспаления в бронхах;

— наличие острой или хронической патологии сердечно-сосудистой системы в анамнезе;

— курение (в последние 12 месяцев).

В группу сравнения включались практически здоровые некурящие добровольцы без патологии легких и сердца. Всего в данной группе обследован 21 человек, из которых 11 добровольцев — взрослые (все мужчины) и 10 -дети (8 мальчиков и 2 девочки). Средний возраст взрослых пациентов в данной группе составил 19,5 ± 2,4 года, в группе детей — 9,1 ± 1,6 лет. Объем форсированного выдоха за 1 секунду в % от должного в этой группе пациентов составил 105, 7 ± 5,4.

Кроме специальных исследований у всех участников группы контроля были проведены сбор анамнеза, перкуссия, аускультация легких, исследован общий анализ крови, общий IgE сыворотки крови, а также проведена компьютерная спирометрия с определением основных объемных и скоростных показателей.

Для оценки степени выраженности воспалительных изменений в бронхиальном дереве у 49 пациентов в межприступный период было проведено бронхологическое обследование со взятием БАЛ и биоптатов слизистой оболочки стенок бронхов. Среди обследованных больных БА у 5 человек имелось легкое персистирующее течение заболевания, у 28 — среднетяжелое пер-систирующее (среди них 20 детей) и у 16 — тяжелое персистирующее течение БА. 10 человек (6 взрослых и 4 ребенка с врожденной патологией бронхов) составили группу сравнения.

Все участники исследования, а в случае обследования детей — их родители или законные представители, были ознакомлены с протоколом исследования, который был составлен в соответствии с требованиями Global Clinical Practices и законами РФ, и подписывали установленную форму информированного согласия, одобренную локальным этическим комитетом.

Методы Получение мокроты, индуцированной 3-5 % гипертоническим раствором NaCI, распыляемым ультразвуковым ингалятором «Омрон» (Япония) по методу Pin et al. (1992 г.);

Компьютерная спирометрия с определением объемных и скоростных показателей проводилась по стандартной методике (Erich Jaeger, Германия);

Хемилюминесцентное определение оксида азота в выдыхаемом воздухе анализатором Logan Research 2149 (Великобритания);

Бронхологическое исследование фибробронхоскопом BF 40 с получением бронхоальвеолярного лаважа и бронхиальных биоптатов стенок бронхов по стандартной методике;

Цитологическое исследование мазков индуцированной мокроты и БАЛ на микроскопе Laborlux S (Германия);

Измерение толщины базальной мембраны в биоптатах бронхов в 10 участках на каждом срезе при увеличении х400 на препаратах толщиной 5-7 мкм, окрашенным гематоксилином и эозином. Кроме того, оценивалось соотношение реснитчатых и бокаловидных клеток на стандартном протяжении эпителиальной выстилки на микроскопе Laborlux S (Германия);

Определение нитратов: исследование на микропланшетном спектрофотометре «Dynatech MRGOO» (Швейцария) супернатанта ИМ и плазмы крови методом Грисса;

Определение эозинофильного катионного протеина (ЭКП) в суперна-танте ИМ проводилось радиоиммунным методом;

Изучение синтеза эйкозаноидов — метаболитов арахидоновой кислоты (простациклина, простагландинов F2a, и Е2, тромбоксана В2 и лейкотриена В4) в БАЛ радиоизотопным методом с использованием экзогенной 14С-арахидоновой кислоты;

Данные описательной статистики представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка, в случае непараметрического распределения — в виде медианы (25-75%). Достоверность различий между исследуемыми группами в случае параметрического распределения признаков оценивалась при

Читайте также:  Ацц при астме принимают

помощи непарного t-критерия Стьюдента. В случае непараметрических данных сравнение проводилось методом Манна-Уитни. Корреляционные связи определяли методом линейной корреляции при параметрических данных и методом ранговой корреляции Спирмена при непараметрическом распределении. Различия считались статистически достоверными при р Дулина, Тамара Рамазановна :: 2009 :: Москва

СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ПАТОГЕНЕЗЕ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ — ОСНОВА ПОИСКА НЕИНВАЗИВНЫХ БИОМАРКЕРОВ ЗАБОЛЕВАНИЯ.стр.

1.1 Роль воспаления в развитие бронхиальной астмы. стр.

1.1.2 Морфологические аспекты патогенеза бронхиальной астмы.стр.

1.1.3 Ключевые клетки и медиаторы.стр.

1.2 Оксид азота — биомаркер бронхиальной астмы.стр.

1.3 Конденсат выдыхаемого воздуха.стр.

1.4 Метод индуцированной мокроты и возможность его применения для оценки характера и интенсивности воспаления дыхательных путей.стр.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.стр.

2.2 Получение и обработка индуцированной мокроты.стр.

2.3 Изучение соединений, растворимых в индуцированной мокроте.стр.

2.3.1 Определение содержания нитритов.стр.

2.3.2 Определение эозинофильного катионного протеина .стр.

2.4 Забор и исследование бронхоальвеолярного лаважа и биоптатов стенок бронхов.стр.

2.4.1 Техника забора и обработки бронхоальвеолярного лаважа.стр.

2.4.2 Техника забора и анализа биоптатов слизистой оболочки бронхов.стр.

2.4.3 Исследование экзогенного биосинтеза эйкозаноидов.стр.

2.5 Определение содержания оксида азота в выдыхаемом воздухе.стр.

2.6 Статистическая обработка результатов.стр.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.стр.

3.1 Исследование клеточного состава индуцированной мокроты и бронхоальвеолярного лаважа.стр.

3.2 Морфометрический анализ состояния стенки бронхов.стр.

3.3 Изучение экзогенного биосинтеза эйкозаноидов гранулоцитами жидкости бронхоальвеолярного лаважа.стр.

3.4 Взаимосвязь цитологического состава индуцированной мокроты с содержанием оксида азота в выдыхаемом воздухе и показателями спирометрии.стр.

3.5 Сравнение концентрации оксида азота в выдыхаемом воздухе и содержания нитратов в плазме крови и индуцированной мокроте.стр.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.стр.

Введение диссертации по теме «Внутренние болезни», Дулина, Тамара Рамазановна, автореферат

Бронхиальная астма (БА) является одним из самых частых бронхолегочных заболеваний человека во всех возрастных группах [37]. Прогресс в изучении патогенеза БА привел к пониманию значения в развитии заболевания двух факторов — воспаления и гиперреактивности бронхов. Возможность мониторирования указанных составляющих патологического процесса у больных БА неодинакова. О гиперреактивности бронхов можно судить по изменению пиковой скорости выдоха (ПСВ) в течение дня и ото дня ко дню с помощью специального портативного прибора пикфлоуметра. Изменение ПСВ на 20% и более в течение дня характерно для БА. Представление о степени повышения тонуса гладкой мускулатуры бронхов, как и о величине бронхиальной обструкции, дает также исследование функции внешнего дыхания (ФВД) особенно при использовании теста с бронхолитиками. Гораздо меньше возможностей для неинвазивной оценки второго фактора. БА — хронического воспаления дыхательных путей. Воспаление при БА чаще всего имеет иммунную природу, является аллергическим воспалением. Описанию морфологического, прежде всего, клеточного субстрата такого специфического воспаления посвящены многочисленные исследования, проводимые с начала XX века до наших дней. Значительно продвинули наше понимание механизмов развития бронхиальной астмы комплексные бронхоскопические исследования с биопсией слизистой и получением лаважной жидкости [31]. Однако эта техника имеет свои ограничения и не относится к неинвазивной. Поэтому не случайно в опубликованном в 1993 году совместном докладе Национального института сердца, легких, крови (США) и Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) «Бронхиальная астма. Глобальная стратегия» в рекомендациях для дальнейших исследований подчеркивается необходимость развития «.надежных неинвазивных тестов, которые могли бы отражать степень воспаления» [6]. За прошедшие 15 лет положение изменилось. Установлено, что к патогенезу БА имеет отношение оксид азота (NO), содержание которого в выдыхаемом воздухе может быть измерено с помощью хемилюминесцентного анализатора Logan Research 2149. В настоящее время повышение концентрации оксида азота в выдыхаемом воздухе признано маркером БА [5]. Вместе с тем, этот неинвазивный метод пока еще дорог и мало доступен. Кроме того, не вполне ясно в какой степени оксид азота связан с воспалением, как таковым, либо с нейрогенной регуляцией дыхательных путей.

Для оценки состояния больных БА может быть исследован конденсат выдыхаемого воздуха, в котором содержатся Н2О2, гистамин, лейкотриены, 8-изопростан, нитротирозин и другие компоненты. Однако все эти вещества находятся в конденсате в чрезвычайно низких концентрациях. Для их определения требуются дорогие высокочувствительные приборы типа атомно-адсорбционного спектрометра. Поэтому соотношение «цена — информация» при исследовании конденсата выдыхаемого воздуха даже более неблагоприятное, чем при определении оксида азота в выдыхаемом воздухе.

Наиболее оптимально это соотношение при использовании метода индуцированной мокроты (ИМ), который заключается в стимуляции усиления выделения мокроты путем ингаляции 3-5 % гипертонического раствора хлорида натрия. К достоинствам метода ИМ относятся: неинвазивность, доступность, возможность оценить как клеточные элементы, так и растворимые вещества, участвующие в воспалении, отсутствие противопоказаний и сколько-нибудь выраженных побочных эффектов. В настоящее время метод применяется главным образом для диагностики рака легких и получения информации о возбудителях инфекции органов дыхания. Однако изучение цитологического состава индуцированной мокроты, по-видимому, может дать возможность оперативно и достоверно судить об активности воспаления дыхательных путей, а исследование цитокинов, содержащихся в супернатанте индуцированной мокроты, способно пролить дополнительный свет на патогенез бронхиальной астмы. Ценность метода ИМ возрастает в последнее время в связи с активными попытками использовать для лечения бронхиальной астмы препараты, альтернативные кортикостероидной терапии, например ингаляции алкилирующего цитостатика мелфалана [32].

Изучить биомаркеры воспаления в индуцированной мокроте и выдыхаемом воздухе у взрослых и детей с бронхиальной астмой.

1. Оценить безопасность и информативность метода индуцированной мокроты для оценки интенсивности воспаления дыхательных путей у больных БА различной степени тяжести.

2. Провести сравнительное изучение цитологических и биохимических показателей ИМ и БАЛ.

3. Дать патогистологическое описание бронхобиоптатов и провести морфометрический анализ стенки бронха в норме и при бронхиальной астме.

4. Изучить содержание NO в выдыхаемом воздухе, концентрацию нитратов в ИМ и плазме крови.

5. Провести корреляционный анализ цитологических, морфометрических показателей, концентрации метаболитов арахидоновой кислоты, а также показателей NO и нитратов при бронхиальной астме у детей и взрослых.

Доказано, что характеристика клеточного состава ИМ одинаково информативна у больных БА взрослого и детского возраста. Выявлена корреляционная зависимость цитологических показателей ИМ от степени тяжести БА и проводимой терапии. При сравнительном изучении у больных БА цитологических и биохимических показателей индуцированной мокроты и бронхоальвеолярного лаважа установлено, что они дополняют друг друга, так как дают адекватную оценку воспалительных изменений в различных отделах респираторного тракта. Найдена взаимосвязь между клеточным составом ИМ и содержанием оксида азота в выдыхаемом воздухе, что свидетельствует об их взаимном участии в воспалении дыхательных путей. Наличие в ИМ клеточных элементов острого воспаления, повышенное содержание NO в выдыхаемом воздухе, выявленные патоморфологические признаки воспаления в биоптатах стенки бронха и увеличение синтеза эйкозаноидов у больных БА в стадии ремиссии заболевания указывают на персистенцию аллергического воспаления дыхательных путей. Показана возможность определения концентрации эозинофильного катионного протеина в индуцированной мокроте и выявлена положительная корреляционная взаимосвязь этого показателя с содержанием оксида азота в выдыхаемом воздухе. Установлено, что процесс усиленного эндогенного синтеза NO повышает уровень нитратов в ИМ, не повышая их концентрацию в плазме крови. Обнаружена прямая корреляционная зависимость между концентрацией оксида азота в выдыхаемом воздухе и содержанием нитратов в ИМ, что позволяет рекомендовать использование метода изучения содержания нитратов в индуцированной мокроте при отсутствии возможности определения оксида азота в выдыхаемом воздухе.

Внедрение в широкую клиническую практику неинвазивного, безопасного и информативного метода индуцированной мокроты совместно с изучением выдыхаемого оксида азота поможет объективно оценить состояние больных БА во время обострения заболевания и в период ремиссии. Данные методы могут применяться на базе поликлиник, клинико-диагностических центров, использоваться в стационарах для диагностики бронхиальной астмы, при проведении дифференциальной диагностики, при изучении наличия и степени выраженности воспалительных изменений в бронхиальном дереве, при подборе противовоспалительной терапии и оценке ее эффективности. Использование изученных неинвазивныех методов особенно оправдано при обследовании детей, страдающих бронхиальной астмой, так как большинство стандартных методов исследования оказываются неинформативнымн, особенно в период ремиссии заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При сравнительном изучении у больных БА цитологических и биохимических показателей индуцированной мокроты и бронхоальвеолярного лаважа установлено, что они дополняют друг друга, так как дают адекватную оценку воспалительных изменений в различных отделах респираторного тракта.

2. Повышенное содержание оксида азота в выдыхаемом воздухе и увеличение в 11 раз доли эозинофилов в индуцированной мокроте по сравнению со здоровыми, подтверждают персистенцию аллергического воспаления дыхательных путей в стадии ремиссии заболевания.

3. Установлено, что процесс усиленного эндогенного синтеза оксида азота повышает уровень нитратов в ИМ у больных БА по сравнению со здоровыми добровольцами, что отражает выраженность воспаления. Концентрация нитратов в плазме крови больных БА практически не отличается от группы сравнения и не зависит от тяжести БА.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 4 глав: обзора литературы, описания методов, собственных исследований и обсуждения результатов исследования, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя. Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский медико-стоматологический университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (ректор — профессор О.О. Янушевич).

источник

Биомаркеры воспаления у больных бронхиальной астмой в индуцированной мокроте и выдыхаемом воздухе Дулина Тамара Рамазановна

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ‘, MOUSEOFF, FGCOLOR, ‘#FFFFCC’,BGCOLOR, ‘#393939’);» onMouseOut=»return nd();»> Диссертация — 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат — бесплатно , доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Дулина Тамара Рамазановна. Биомаркеры воспаления у больных бронхиальной астмой в индуцированной мокроте и выдыхаемом воздухе : диссертация . кандидата медицинских наук : 14.00.05 / Дулина Тамара Рамазановна; [Место защиты: ГОУВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет»].- Москва, 2009.- 91 с.: ил.

Глава 1. Современные представления о патогенезе бронхиальной астмы — основа поиска неинвазивных биомаркеров заболевания стр. 11

1.1 Роль воспаления в развитие бронхиальной астмы . стр. 11

1.1.2 Морфологические аспекты патогенеза бронхиальной астмы стр. 13

1.1.3 Ключевые клетки и медиаторы стр. 16

1.2 Оксид азота — биомаркер бронхиальной астмы стр. 21

1.3 Конденсат выдыхаемого воздуха стр. 27

1.4 Метод индуцированной мокроты и возможность его применения для оценки характера и интенсивности воспаления дыхательных путей стр. 29

Глава 2. Материалы и методы стр.36

2.2 Получение и обработка индуцированной мокроты стр. 41

2.3 Изучение соединений, растворимых в индуцированной мокроте стр. 42

2.3.1 Определение содержания нитритов стр. 42

2.3.2 Определение эозинофильного катионного протеина стр. 43

2.4 Забор и исследование бронхоальвеолярного лаважа и биоптатов стенок бронхов стр. 43

2.4.1 Техника забора и обработки бронхоальвеолярного лаважа стр. 43

2.4.2 Техника забора и анализа биоптатов слизистой оболочки бронхов стр. 45

2.4.3 Исследование экзогенного биосинтеза эйкозаноидов стр. 45

2.5 Определение содержания оксида азота в выдыхаемом воздухе стр. 45

2.6 Статистическая обработка результатов стр. 46

Глава 3. Результаты исследования стр. 47

3.1 Исследование клеточного состава индуцированной мокроты и бронхоальвеолярного лаважа стр. 47

3.2 Морфометрический анализ состояния стенки бронхов..стр. 53

3.3 Изучение экзогенного биосинтеза эйкозаноидов гранулоцитами жидкости бронхоальвеолярного лаважа стр. 60

3.4 Взаимосвязь цитологического состава индуцированной мокроты с содержанием оксида азота в выдыхаемом воздухе и показателями спирометрии стр. 65

3.5 Сравнение концентрации оксида азота в выдыхаемом воздухе и содержания нитратов в плазме крови и индуцированной мокроте стр. 70

Глава 4. Обсуждение результатов стр. 73

Практические рекомендации стр. 93

Указатель литературы стр.94

Бронхиальная астма (БА) является одним из самых частых бронхолегочных заболеваний человека во всех возрастных группах [37]. Прогресс в изучении патогенеза БА привел к пониманию значения в развитии заболевания двух факторов — воспаления и гиперреактивности бронхов. Возможность мониторирования указанных составляющих патологического процесса у больных БА неодинакова. О гиперреактивности бронхов можно судить по изменению пиковой скорости выдоха (ПСВ) в течение дня и ото дня ко дню с помощью специального портативного прибора пикфлоуметра. Изменение ПСВ на 20% и более в течение дня характерно для БА. Представление о степени повышения тонуса гладкой мускулатуры бронхов, как и о величине бронхиальной обструкции, дает также исследование функции внешнего дыхания (ФВД) особенно при использовании теста с бронхолитиками. Гораздо меньше возможностей для неинвазивной оценки второго фактора. БА — хронического воспаления дыхательных путей. Воспаление при БА чаще всего имеет иммунную природу, является аллергическим воспалением. Описанию морфологического, прежде всего, клеточного субстрата такого специфического воспаления посвящены многочисленные исследования, проводимые с начала XX века до наших дней. Значительно продвинули наше понимание механизмов развития бронхиальной астмы комплексные бронхоскопические исследования с биопсией слизистой и получением лаважной жидкости [31]. Однако эта техника имеет свои ограничения и не относится к неинвазивной. Поэтому не случайно в опубликованном в 1993 году совместном докладе Национального института сердца, легких, крови (США) и Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) «Бронхиальная астма. Глобальная стратегия» в рекомендациях для дальнейших исследований подчеркивается

5 необходимость развития «. надежных неинвазивных тестов, которые могли бы отражать степень воспаления» [6]. За прошедшие 15 лет положение изменилось. Установлено, что к патогенезу БА имеет отношение оксид азота (NO), содержание которого в выдыхаемом воздухе может быть измерено с помощью хемилюминесцентного анализатора Logan Research 2149. В настоящее время повышение концентрации оксида азота в выдыхаемом воздухе признано маркером БА [5]. Вместе с тем, этот неинвазивный метод пока еще дорог и мало доступен. Кроме того, не вполне ясно в какой степени оксид азота связан с воспалением, как таковым, либо с нейрогенной регуляцией дыхательных путей.

Читайте также:  Пентоксифиллин при бронхиальной астме

Для оценки состояния больных БА может быть исследован конденсат выдыхаемого воздуха, в котором содержатся Н2О2, гистамин, лейкотриены, 8-изопростан, нитротирозин и другие компоненты. Однако все эти вещества находятся в конденсате в чрезвычайно низких концентрациях. Для их определения требуются дорогие высокочувствительные приборы типа атомно-адсорбционного спектрометра. Поэтому соотношение «цена — информация» при исследовании конденсата выдыхаемого воздуха даже более неблагоприятное, чем при определении оксида азота в выдыхаемом воздухе.

Наиболее оптимально это соотношение при использовании метода индуцированной мокроты (ИМ), который заключается в стимуляции усиления выделения мокроты путем ингаляции 3-5 % гипертонического раствора хлорида натрия. К достоинствам метода ИМ относятся: неинвазивность, доступность, возможность оценить как клеточные элементы, так и растворимые вещества, участвующие в воспалении, отсутствие противопоказаний и сколько-нибудь выраженных побочных эффектов. В настоящее время метод применяется главным образом для диагностики рака легких и получения информации о возбудителях инфекции органов дыхания. Однако изучение цитологического состава

индуцированной мокроты, по-видимому, может дать возможность оперативно и достоверно судить об активности воспаления дыхательных путей, а исследование цитокинов, содержащихся в супернатанте индуцированной мокроты, способно пролить дополнительный свет на патогенез бронхиальной астмы. Ценность метода ИМ возрастает в последнее время в связи с активными попытками использовать для лечения бронхиальной астмы препараты, альтернативные кортикостероидной терапии, например ингаляции алкилирующего цитостатика мелфалана [32].

Изучить биомаркеры воспаления в индуцированной мокроте и выдыхаемом воздухе у взрослых и детей с бронхиальной астмой.

Оценить безопасность и информативность метода индуцированной мокроты для оценки интенсивности воспаления дыхательных путей у больных БА различной степени тяжести.

Провести сравнительное изучение цитологических и биохимических показателей ИМ и БАЛ.

Дать патогистологическое описание бронхобиоптатов и провести морфометрический анализ стенки бронха в норме и при бронхиальной астме.

Изучить содержание NO в выдыхаемом воздухе, концентрацию нитратов в ИМ и плазме крови.

Провести корреляционный анализ цитологических, морфометрических показателей, концентрации метаболитов

7 арахидоновой кислоты, а также показателей NO и нитратов при бронхиальной астме у детей и взрослых.

Доказано, что характеристика клеточного состава ИМ одинаково информативна у больных БА взрослого и детского возраста. Выявлена корреляционная зависимость цитологических показателей ИМ от степени тяжести БА и проводимой терапии. При сравнительном изучении у больных БА цитологических и биохимических показателей индуцированной мокроты и бронхоальвеолярного лаважа установлено, что они дополняют друг друга, так как дают адекватную оценку воспалительных изменений в различных отделах респираторного тракта. Найдена взаимосвязь между клеточным составом ИМ и содержанием оксида азота в выдыхаемом воздухе, что свидетельствует об их взаимном участии в воспалении дыхательных путей. Наличие в ИМ клеточных элементов острого воспаления, повышенное содержание NO в выдыхаемом воздухе, выявленные патоморфологические признаки воспаления в биоптатах стенки бронха и увеличение синтеза эйкозаноидов у больных БА в стадии ремиссии заболевания указывают на персистенцию аллергического воспаления дыхательных путей. Показана возможность определения концентрации эозинофильного катионного протеина в индуцированной мокроте и выявлена положительная корреляционная взаимосвязь этого показателя с содержанием оксида азота в выдыхаемом воздухе. Установлено, что процесс усиленного эндогенного синтеза N0 повышает уровень нитратов в ИМ, не повышая их концентрацию в плазме крови. Обнаружена прямая корреляционная зависимость между концентрацией оксида азота в выдыхаемом воздухе и содержанием нитратов в ИМ, что позволяет рекомендовать использование метода изучения содержания нитратов в индуцированной мокроте при отсутствии возможности определения оксида азота в выдыхаемом воздухе.

Внедрение в широкую клиническую практику неинвазивного, безопасного и информативного метода индуцированной мокроты совместно с изучением выдыхаемого оксида азота поможет объективно оценить состояние больных БА во время обострения заболевания и в период ремиссии. Данные методы могут применяться на базе поликлиник, клинико-диагностических центров, использоваться в стационарах для диагностики бронхиальной астмы, при проведении дифференциальной диагностики, при изучении наличия и степени выраженности воспалительных изменений в бронхиальном дереве, при подборе противовоспалительной терапии и оценке ее эффективности. Использование изученных неинвазивныех методов особенно оправдано при обследовании детей, страдающих бронхиальной астмой, так как большинство стандартных методов исследования оказываются неинформативными, особенно в период ремиссии заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту

При сравнительном изучении у больных БА цитологических и биохимических показателей индуцированной мокроты и бронхоальвеолярного лаважа установлено, что они дополняют друг друга, так как дают адекватную оценку воспалительных изменений в различных отделах респираторного тракта.

Повышенное содержание оксида азота в выдыхаемом воздухе и увеличение в И раз доли эозинофилов в индуцированной мокроте по сравнению со здоровыми,

9
подтверждают персистенцию аллергического воспаления
дыхательных путей в стадии ремиссии заболевания.
3. Установлено, что процесс усиленного эндогенного синтеза

оксида азота повышает уровень нитратов в ИМ у больных БА по сравнению со здоровыми добровольцами, что отражает выраженность воспаления. Концентрация нитратов в плазме крови больных БА практически не отличается от группы сравнения и не зависит от тяжести БА.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 4 глав: обзора литературы, описания методов, собственных исследований и обсуждения результатов исследования, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя. Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский медико-стоматологический университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (ректор — профессор О.О. Янушевич).

Клинические наблюдения и сбор материала проводились на базе городской клинической больницы № 57 (главный врач — И. А. Назарова), НИИ Педиатрии Научного центра здоровья детей РАМН (директор -академик РАМН, доктор медицинский наук, профессор А.А. Баранов).

Биопсия слизистой бронхов, цитологическое исследование индуцированной мокроты и бронхоальвеолярного лаважа, морфологическое исследование биоптатов, а также определение оксида азота в выдыхаемом воздухе осуществлено в ФГУ «Научно-исследовательском институте пульмонологии» ФМБА России (директор -академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор А.Г. Чучалин).

10
Спектрофотометрическое исследование супернатанта

индуцированной мокроты и изучение синтеза эикозаноидов в бронхоальвеолярном лаваже проводилось в НИИ физико-химической медицины Росздрава (директор — академик РАМН, профессор В.И. Сергиенко), а также в отделе молекулярной биологии и экологии Российского государственного медицинского университета (ректор — академик РАМН, профессор Н.Н. Володин).

Бронхиальная астма является одним из самых частых заболеваний человека [8]. Распространенность Б А в США достигает 5 % общей популяции населения и имеет неуклонную тенденцию к росту. В некоторых странах летальность от БА за последнее десятилетие возросла более чем в два раза [14, 24, 33]. В совместном докладе Национального института сердца, легких, крови США и Всемирной организации здравоохранения «Бронхиальная астма. Глобальная стратегия» [11] подчеркнута важная роль воспаления в патогенезе заболевания, что находит отражение в следующих ключевых положениях: Астма — вне зависимости от её тяжести — хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей. Воспаление в дыхательных путях связано с гиперреактивностью бронхов, бронхиальной обструкцией, респираторными симптомами. Воспаление в дыхательных путях вызывает четыре механизма формирования бронхиальной обструкции: острый бронхоспазм, отек стенки бронха, формирование слизистых пробок и перестройку стенки бронха. В патогенезе различных форм БА важную роль играют нейрогенные механизмы воспаления

Из-за отсутствия достоверных неинвазивных методов изучения воспаления при астме клиницистам и эпидемиологам приходится полагаться на опосредованные признаки. Поэтому в докладе дается следующее рабочее описание бронхиальной астмы, основанное на функциональных расстройствах, как следствии воспаления:

«Астма — хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей, в котором принимают участие многие клетки: тучные клетки, эозинофилы и Т-лимфоциты. У предрасположенных лиц это воспаление приводит к повторяющимся эпизодам хрипов, одышки, тяжести в грудной клетке и кашлю, особенно ночью и/или ранним утром. Эти симптомы обычно сопровождаются распространенной, но вариабельной обструкцией бронхиального дерева, которая, по крайней мере, частично обратима спонтанно или под влиянием лечения. Воспаление также вызывает содружественное увеличение ответа дыхательных путей на различные стимулы».

Учитывая сложившееся положение в рекомендациях для дальнейших исследований первым, наиболее приоритетным направлением обозначено: «Развитие надежных неинвазивных тестов, которые могли бы отражать степень воспаления. Его оценка может приуменьшаться, если исследователь полагается только на изучение функции легких».

Доклад «Бронхиальная астма. Глобальная стратегия» сыграл очень большую роль в ускорении изучения БА и прогрессе методов лечения заболевания. Через 6 лет вышла его новая версия «Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы. Пересмотр 2002 г.» [11]. Однако и в этом документе осталась неизменной рекомендация: «необходимы достоверные неинвазивные тесты, которые отражают воспалительную реакцию при БА». В этиологии БА выделяют [7]: предрасполагающие факторы (наследственность, атопия); причинные факторы (домашние и природные аллергены, профессиональные и лекарственные вещества антигенной или гаптеновой природы); способствующие факторы (детский возраст, респираторные инфекции, воздушные поллютанты, активное и пассивное курение); факторы, провоцирующие приступ удушья — триггеры (воздушные и пищевые аллергены, физическая нагрузка, смог, эмоциональный стресс, гастроэзофагальный рефлюкс, острая инфекция верхних дыхательных путей и респираторного тракта). Различают иммунологическую, патохимическую и патофизиологическую стадию развития патологического процесса. Воспалительные изменения при Б А ассоциированы с бронхиальной гиперреактивностью. Механизм этой связи изучен недостаточно [13, 15]. Воспаление дыхательных путей является персистирующим. Хроническое воспаление имеет место при всех клинических формах заболевания, у пациентов любого возраста и пола [9, 81].

Но взаимосвязь между тяжестью БА и интенсивностью воспаления до конца не установлена [3, 53]. Патофизиологический спастический эффект воспаления наиболее отчетливо представлен в бронхах среднего калибра, обладающих наибольшим мышечным слоем.

Морфологические исследования бронхобиопсий привели к пониманию БА как воспалительного заболевания дыхательных путей [53]. Наиболее характерной чертой аллергического воспаления при БА является утолщение стенки дыхательных путей. Это часто сопровождается повреждением эпителия, утолщением базальной мембраны, значительным увеличением бронхиального капиллярного русла, экссудацией и отеком, гиперплазией бокаловидных клеток, гиперплазией и гипертрофией гладкомышечных клеток. Эозинофилы во всех случаях являются основными клетками воспаления. Инфильтраты в стенках бронхов состоят преимущественно из эозинофилов [53].

При исследовании биоптатов больных БА были обнаружены следующие морфологические изменения: в расширенных просветах бронхов слизистые пробки, пласты слущенного эпителия с примесью нейтрофилов, эозинофилов, лимфоцитов, почти полное оголение базальной мембраны. В сохранном эпителии увеличено число бокаловидных клеток. Обнаруживается расширение и резкое полнокровие капилляров слизистой оболочки и подслизистого слоя. Базальная мембрана обычно неравномерно утолщена, до 5-20 мкм, часто в ней видны поперечные «проходы», перпендикулярно к просвету бронха, очаговая резорбция отдельных участков базальной мембраны, что является следствием действия эозинофильного катионного протеина и основного щелочного белка эозинофилов. Субэпителиальная зона почти на всем протяжении густо инфильтрирована полинуклеарами и эозинофилами. Выраженный отек стромы и полнокровие расширенных капилляров, гиперплазия желез и переполнение их ШИК(+) материалом. Отмечается гипертрофия и дистрофия миоцитов, но при морфометрии объемная плотность не отличалась от таковой в группе сравнения, что связано с выраженным отеком стенки [53].

R. Rajah [117] в качестве одного из механизмов гипертрофии и дистрофии миоцитов предлагает опосредованное воздействие на них ЛтВ4 (через инсулиноподобный фактор роста). Уровень последнего в биоптатах больных с БА оказался в несколько раз выше, чем в контрольной группе здоровых добровольцев [117].

Признаками бронхоспазма является обнаружение в просветах незаполненных слизью бронхов пластов десквамированного эпителия, а также циркулярное утолщение хрящевых пластинок и захождение их одна за другую [87].

M. Guilbert et al. (1999) установили, что феномен прохождения клеток через базальную мембрану регулируется фактором активации тромбоцитов, ИЛ-4, 5, рядом протеиназ и одним из метаболитов АК -эикозотетраеновои кислотой. Провоспалительная активность последней в несколько раз выше фактора активации тромбоцитов [78].

Обнаружено преобладание склеротических изменений в слизистой оболочке крупных бронхов без выраженной воспалительно-клеточной инфильтрации, стадийность изменений слизистой оболочки (катаральные, катарально-склеротические, склеротические изменения). Установлена взаимосвязь между состоянием покровного эпителия и прогнозированием патологического процесса в бронхах (появление «отростачатых» клеток является признаком начинающейся плоскоклеточной метаплазии эпителия). На основании 76 наблюдений исследователи пришли к выводу об обратимости плоскоклеточной метаплазии (реверсия многослойного плоского эпителия в многорядный цилиндрический) [78].

В развитии воспаления при БА принимают участие различные клетки и медиаторы [102, 103]. В бронхиальном дереве у больных астмой выявляются тучные клетки, эозинофилы, Т-лимфоциты, дендритные клетки, макрофаги и нейтрофилы. Структурные клетки стенки бронхов продуцируют воспалительные медиаторы и способствуют персистенции воспалительного процесса в дыхательных путях.

Тучные клетки слизистой дыхательных путей высвобождают бронхоконстрикторные медиаторы — гистамин, цистениловые лейкотриены, простагландин D2 [105]. Эти клетки активируются как аллергенами через высокоафффинные IgE-рецепторы, так и осмотическими стимулами. Последний механизм вызывает спазм бронхов, индуцированный физической нагрузкой. Увеличение числа тучных клеток в гладкомышечной мускулатуре бронхов ассоциировано с бронхиальной гиперреактивностью [102, 109].

Эозинофилы, в большом количестве присутствующие в бронхах, секретируют основные протеины, повреждающие эпителиальные клетки дыхательных путей. Они также могут высвобождать факторы роста и таким путем участвовать в ремоделировании бронхиальной стенки [55].

Т-лимфоциты в бронхах продуцируют ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-9 и ИЛ-13, которые поддерживают эозинофильное воспаление и продукцию В-лимфоцитами иммуноглобулина Е [129]. В бронхоальвеолярном лаваже у больных БА увеличено количество Т-лимфоцитов — естественных киллеров (iNKN-клеток), продуцирующих большое количество ИЛ-4 и интерферона у, участвуя таким образом в развитии воспаления дыхательных путей [93].

Дендритные клетки захватывают аллергены с поверхности бронхов и переносят их в региональные лимфатические узлы. Там они взаимодействуют с регуляторными Т-клетками и участвуют в стимулировании образования Т-хелперов 2-го типа [129]. Активированные макрофаги в бронхиальной стенке секретируют цитокины и медиаторы, способствующие развитию воспаления [100]. У больных тяжелой формой БА и у курящих астматиков увеличивается число нейтрофилов в бронхах и мокроте, но патофизиологическая роль этих клеток в становлении БА до сих пор не установлена. Есть мнение, что повышение их количества связано с глюкокортикостероидной терапией [45].

Читайте также:  Антилейкотриеновые препараты для лечения астмы

Клетки бронхиального эпителия подвергаются воздействию вирусов, поллютантов, ингаляционных аллергенов и выделяют множество воспалительных протеинов, цитокинов, хемокинов и липидных медиаторов.

Эндотелиальные клетки сосудов участвуют в переходе моноцитов, лимфоцитов и лейкоцитов из кровеносных сосудов в дыхательные пути. Кровеносные сосуды бронхов пролиферируют под влиянием сосудистого эндотелиального фактора роста.

Вследствие повышения числа бокаловидных клеток в эпителии бронхов и увеличении размеров подслизистых желез возрастает секреция слизи.

Основным механизмом нарушения бронхиальной проходимости является сокращение гладкомышечной мускулатуры бронхов под влиянием множества бронхоконстрикторных медиаторов и нейротрансмиттеров.

В последние годы большое внимание уделяется изучению растворимых факторов — медиаторов и цитокинов, которые являются продуктами секреции клеток воспаления. Среди биологически активных веществ, выделяемых различными клетками воспаления, большую роль играют продукты обмена арахидоновой кислоты (С2о:4) — эйкозаноиды [85].

Название это происходит от греческого числительного «двенадцать». Именно столько углеродных атомов содержится в их молекулах.

Арахидоновая кислота (АК) входит в состав фосфолипидов клеточных мембран. Количество её достигает 1% от всех свободных жирных кислот мембран клеток [58, 61]. Активация синтеза эйкозаноидов в легких в настоящее время представляется следующим образом [90, 96]. Аллерген, инфекционный агент или токсины стимулируют интенсивность липидного метаболизма клеток, первым звеном которого является активация фосфолипаз Аг, С или D. В результате активации фосфолипаз АК высвобождается из фосфолипидов клеточных мембран в свободном виде. В настоящее время считается доказанным, что повышенная концентрация АК в легочной ткани у больных БА связана как с поступлением её с пищей, так и с активностью ферментативных систем, участвующих в метаболизме полиненасыщенных жирных кислот (ГТНЖК). Свободная АК, в свою очередь, является субстратом для синтеза эйкозаноидов. Последние делятся на три основные группы по названию клеток, в которых впервые были открыты: лейкотриены (ЛТ), тромбоксаны (ТО) и простагландины (ПГ). Лейкотриены были найдены в лейкоцитах, тромбоксаны — в тромбоцитах. О простагландинах первоначально полагали, что они образуются в предстательной железе, но позже оказалось, что они синтезируются во многих тканях, кроме простаты. Синтез простагландинов и тромбоксанов осуществляется ферментом циклоксигеназой (ЦОГ), активность которого ингибируется аспирином. Лейкотриены синтезирует фермент липоксигеназа (ЛОГ). Активность указанных ферментов у больных Б А существенно повышена [2, 96]. Усиленный синтез различных типов эйкозаноидов при БА осуществляется в разных клетках: эозинофилы синтезируют лейкотриен (Лт) С4; базофилы и тучные клетки — цистеиновые лейкотриены С4, D4, Е4, и простагландин (Пг) D2; нейтрофилы и альвеолярные макрофаги — лейкотриен В4; эпителиальные клетки — простагландины Е2, F2, D2 и простациклин (Пц) 12 [25,61,90].

В физиологических условиях существуют системы, ингибирующие синтез эйкозаноидов. Тормозящее действие оказывает липокортин — высокополярный протеин, представленный в различных клетках, включая моноциты и нейтрофилы. Образование липокортина регулируется уровнем циркулирующих в организме кортикостероидов, которые активируют его синтез. Действие липокортина связано с ингибированием активности фосфолипазы А2. [104]. Р.Т. Van-Hal (1996) установил обратную корреляционную зависимость между уровнем липокортина и выбросом бронхоконстрикторных простагландинов в жидкости БАЛ больных БА и положительную корреляционную связь между уровнем липокортина и дозой ингаляционных ГКС [132].

Биологическое действие Пг и Лт осуществляется с помощью рецепторов, локализующихся на мембранах клеток различных тканей [106]. Бронхоконстрикторы rirD2, llrF2a и ТхА2 действуют на один и тот же рецептор ТхА2. Действие ЛтВ4 опосредовано через специфический рецептор к этому лейкотриену. Для всех сульфодипетидных лейкотриенов (C4/D4/E4) также существует только один рецептор [121].

Индукция мокроты осуществлялась гипертоническим 3-5 % раствором NaCI через ультразвуковой небулайзер «Омрон», Япония. До начала процедуры больной делал 2 вдоха (200 мкг) сальбутамола. Премедикация В2-агонистами позволяет предотвратить бронхоспазм во время ингаляции гипертонического раствора NaCI и в то же время не оказывает влияние на изучаемые показатели воспаления. До начала процедуры проводилось измерение показателей жизненной емкости легких и объема форсированного выдоха за 1 секунду. Если объем форсированной емкости легких ниже 60% от должного проведение процедуры противопоказано. Ингаляция проводилась сеансами по 5-7 минут, общая продолжительность не превышала 30 минут. Каждые 7 мин ингаляции концентрацию раствора повышали на 1 %, то есть последовательно использовали 3, 4 и 5 % солевые растворы. До и после каждого сеанса ингаляции определяли показатели жизненной емкости легких и объема форсированного выдоха. При снижении ОФВ] на 10 % концентрацию гипертонического раствора не повышали, при снижении ОФВ і на 20 % ингаляцию прекращали. Ингаляция прекращалась также при появлении свистящего дыхания или симптомов удушья. После каждого сеанса ингаляции пациенты тщательно прополаскивали рот и глотку, а затем откашливали мокроту в специальную посуду. Желательный объем мокроты составлял не менее 2-х мл с минимальной примесью слюны. Мокрота хранилась при температуре тающего льда + 4С и исследовалась

на протяжении 2-х часов. Первый этап заключался в диспергировании и гомогенизации мокроты. Для этого использовался дитиотриетол (ДТТ) — вещество с низким окислительно-восстановительным потенциалом, разрушающее дисульфидные связи гликопротеинов слизистого секрета и не оказывающее влияние на клеточные и растворимые факторы мокроты. Смесь мокроты с ДТТ встряхивали 10 мин, клеточную суспензию отмывали в сбалансированном растворе Хенкса, фильтровали через нейлоновую марлю и центрифугировали в течение 10 мин при 1000 оборотов/мин (450 g). Затем в камере Горяева определяли число клеток, их жизнеспособность, окрашиваали мазки по Романовскому-Гимза и подсчитывали различные клеточные элементы. После центрифугирования супернатант использовался для определения растворимых элементов мокроты. Цитологическое исследование мазков проводилось с помощью микроскопа Labrolux S (Германия).

Определение содержания нитратов в супернатанте ИМ проводилось спектрофотометрическим методом с реактивом Грисса. Метод основан на цветной реакции нитратных ионов с реактивом Грисса, которая стабильна в течение суток, спектрофотометрия проводиась при длине волны 540 нм. Реакционная смесь: 1. Сульфаниламид 1% в 5% растворе фосфорной кислоты — 500 мкл 2. N-(1 нафтил)этилендиамин — 500 мкл 3. Образец (плазма, супернатант ИМ) — 50 мкл

Смесь инкубировалась при комнатной температуре в течение 10 минут. Измерение оптической плотности пробы проводилось при длине волны 540 нм против холостой пробы (вместо 50 мкл образца использовался равный объем 10 мМ фосфатного буфера, рН=7,4). По предварительно построенной калибровочной кривой определялось содержание нитрита. Исследование проводилось на микропланшетном спектрофотометре «Dynatech MRGOO» (Швейцария).

Процедура бронхологического исследования выполнялась под местной анестезией 2 % лидокаина фибробронхоскопом BF-30 фирмы «Olympus» по стандартной методике. Оценку эндоскопической картины во время исследования проводили по классификации Г.И. Лукомского [23] с выделением 3 степеней интенсивности воспаления слизистой оболочки бронхов: 1 степень — слизистая оболочка бронхов бледно-розового цвета, сосудистый рисунок смазан, стерт за счет отека слизистой оболочки бронхов, несколько стирает рельеф хрящевых колец. Слизистый секрет в просвете бронха в умеренном или большом количестве. 2 степень — слизистая оболочка бронхов ярко-красного цвета, отечна, за счет чего межкольцевые промежутки сглажены, сосудистый рисунок не определяется. Устья сегментарных и субсегментарных бронхов сужены. Секрет слизисто- гнойный, вязкий или жидкий, в умеренном или большом количестве. степень — слизистая оболочка бронхов багрово-синюшного цвета, утолщена, сосудистый рисунок не определяется за счет отека слизистой оболочки, межкольцевые промежутки полностью сглажены. Устья долевых и особенно сегментарных бронхов резко сужены, иногда до точечного, шпоры расширены, малоподвижны. Секрет гнойный, вязкий или жидкий, в очень большом объеме, требующем постоянной аспирации.

Одновременно производился забор лаважной жидкости. Для получения БАЛ бронхиальное дерево омывали большим количеством подогретого до 37С физиологического раствора. После промывания раствор полностью аспирировали из бронхиального дерева. Бронхоскоп вводили в устье сегментарного бронха, окклюзируя его. Через биопсийный канал эндоскопа проводили полиэтиленовый катетер и через него в просвет сегментарного бронха вводили 25 мл физиологического раствора, который затем полностью аспирировали. Затем катетер продвигали на 6-7 см вглубь сегментарного бронха и дробно вводили по 25-50 мл физиологического раствора общим объемом от 50 до 100 мл, в зависимости от состояния пациентов, который каждый раз полностью аспирировали. Эти смешанные между собой порции и составляют БАЛ.

Полученную бронхоальвеолярную жидкость отбирали в пластиковую пробирку, фильтровали через марлю и центрифугировали при 1000 оборотов в минуту в течение 10 минут. Затем в камере Горяева определяли число клеток, их жизнеспособность, окрашивали мазки по Романовскому — Гимза и подсчитывали различные клеточные элементы. Полученную жидкую фазу (супернатант) исследовали на наличие растворимых факторов воспаления. Цитологическое исследование мазков бронхоальвеолярного лаважа проводилось с помощью микроскопа Labrolux S (Германия).

При сравнении цитологического состава индуцированной мокроты и бронхе альвеолярного лаважа у детей, страдающих среднетяжелой персистируюіцей бронхиальной астмой в стадии ремиссии, следует отметить, что соотношение клеточных элементов оказалось статистически достоверно различным. Так альвеолярных макрофагов в ИМ обнаружено почти в 2 раза меньше, чем в БАЛ. Нейтрофилов, напротив, в 3,5 раза, а эозинофилов в 4 раза было больше в ИМ. При сравнении клеточного состава ИМ и БАЛ у здоровых лиц различия связаны с содерэ/санием нейтрофилов, которых в ИМ было достоверно выше. При изучении цитологического состава ИМ у больных с разной степенью выраженности патологического процесса выявлено, что доля эозинофилов в ИМ при среднетяжелой персистирующей Б А в 11 раз больше, чем у больных легкой персистирующей степенью тяжести и в 18 выше, чем в группе сравнения. Доля эозинофилов в ИМ у детей, страдающих среднетяжелой персистирующей БА, оказалось в 11 раз больше, чем у здоровых лиц, несмотря на то, что исследование проводилось в период стойкой ремиссии. Таким образом, можно утверждать, что процентное содержание эозинофилов в ИМ больных БА отражает степень выраженности аллергического воспаления. Также обнаружено, что в цитограмме ИМ при любой степени тяжести, даже в период ремиссии, выявлена высокая доля содержания и других клеточных элементов воспаления — нейтрофилов.

Проводимая гормональная противовоспалительная терапия оказала выраженное влияние на клеточный состав ИМ. Прием пероралъных кортикостероидов уменьшил среднее содержание эозинофилов в 18 раз, в то время как количество нейтрофилов увеличилось почти в двое. Это указывает на то, что в первую очередь оказался подавленным аллергический компонент воспаления.

При сравнении клеточного состава ИМ и БАЛ при бронхиальной астме тяжелого персистирующего течения в обоих случаях обращает на себя внимание тенденция к повышению уровня нейтрофилов и снижению уровня макрофагов. Обнаружена достоверная обратная корреляция между уровнями макрофагов и нейтрофилов в ИМ (г = -0,94; р 0,01).

Необходимо отметить, что ни у одного обследованного (здоровые добровольцы, больные БА, взрослые и дети) при получении ИМ ни в одном наблюдении не выявлено появления признаков затрудненного дыхания и других осложнений; лишь у И обследованных после процедуры появлялся соленый привкус.

При патологоанатомическом исследовании бронхобиопсий проводилось сопоставление степени тяжести БА, степени выраженности эндобронхита и морфологической формы хронического бронхита.

При легкой персистирующей степени тяжести эндоскопически выявлен катаральный эндобронхит 1 степени, морфологически у 1 больного — хронический катаральный бронхит (КБ), что соответствовало степени эндобронхита и клиническому течению. У двух больных -морфологически катарально-склеротический (КСБ), у двух пациентов -картина склеротического бронхита (СБ), то есть степень патологии бронха у 4 и 5 пациентов более выражена, чем клиническое течение БА.

При среднетяжелой персистирующей БА у 19 пациентов эндоскопически был выявлен катаральный эндобронхит 1 степени, у 8 пациентов — катаральный бронхит 2 степени, у 1 исследуемого патологии не выявлено. Морфологически при эндобронхите 1 степени у 5 пациентов наблюдалась картина КСБ, у 14 больных — картина КБ. При эндобронхите 2 степени морфологически выявлена картина СБ. Таким образом, в этой группе пациентов в большинстве наблюдений степень выраженности морфологических изменений была ниже клинических проявлений, а в 8 случаях значительно выше — склеротический бронхит.

Наибольшее несоответствие степени тяжести и морфологической картины наблюдалось у больных тяжелой персистирующей БА. У 13 из 16 наблюдений эндоскопически установлен катаральный эндобронхит 1 степени. При этом у 11 пациентов морфологически обнаружен катаральный бронхит, у двух из 13 пациентов выявлен КСБ, у одного — СБ с атрофией слизистой оболочки и массивной лимфогистиоцитарной инфильтрацией собственной пластинки слизистой и подслизистого слоя. У оставшихся трех из 16 больных эндоскопически выявлен эндобронхит 2-3 степени, морфологически у них наблюдались КСБ и СБ. Обнаружить корреляцию между степенью морфологических изменений и длительностью заболевания не удалось.

Следует отметить, что в нашей работе характер и выраженность морфологических изменений в бронхах у детей с БА не отличались от таковых у взрослых пациентов. Сходные гистологические изменения в бронхах при БА у взрослых и детей наблюдали и другие исследователи [32].

В группе сравнения эндоскопически в хрящевых бронхах изменений не выявлено, однако в одном наблюдении морфологически был обнаружен катаральный бронхит и в одном — катарально-склеротический бронхит.

Наиболее характерными морфологическими изменениями при БА являются утолщение стенки дыхательных путей и нарушение соотношения бокаловидных и реснитчатых клеток. Часто это сопровождается повреждением эпителия и утолщением базальной мембраны.

источник